PESQUISA VETERINÁRIA BRASILEIRA

Abstract in English:

The objective of this study was to evaluate the sperm quality obtained of domestic cats by electroejaculation and recovery of the tail of the epididymis after cooling at -1°C and 4°C for 24 and 48 hours. Twenty-nine adult cats (2 to 6kg) were used. Sperm collection was performed by electroejaculation (EEJ), and after 48 hours, the cats were orchiectomized, and sperm sample was obtained from the vas deferens and epididymis tail (EPD). The samples were diluted in ACP-117® extender, and the sperm characteristics were evaluated at three different moments: when still fresh, 24 and 48 hours after cooling. In order to compare the two refrigeration temperatures, the first stage was to analyze if there was a difference between the harvesting techniques. After this, two experiments were conducted: in the first, sperm sample from 14 cats were used and the cooling was performed at -1°C; and in the second, sample from 15 cats were used and the sperm were refrigerated at 4°C. Sperm kinetics were evaluated by computerized analysis (CASA) and concentration by Neubauer chamber, spermatic morphology was evaluated by modified Karras staining, and membrane integrity was evaluated by eosin nigrosine. The results obtained were analyzed in R software, version 3.2.5 using the Mann-Whitney test for variables with abnormal distributions, considering significance at the level of 5%. In ejaculate samples, higher values of total morphological defects were observed after 24 and 48 hours of refrigeration at 4°C (P<0.022) compared to refrigeration at -1°C, using Friedman test. To quantify the decrease in sperm quality, parameter reductions were calculated among time points (F-24h/F-48h/24h-48h). In EPD samples, a greater reduction in sperm quality was detected after 24 hours of refrigeration at 4°C, both in motility and sperm kinetics and in the movement and velocity indices, compared to refrigeration at -1°C. Based on the results, it can be concluded that cooling of feline spermatozoa at -1°C for up to 48 hours was efficient in maintaining spermatic quality collected by EEJ and EPD, and it could be an alternative to spermatozoa cryopreservation in domestic felines.

• Refrigeration spermatozoa domestic cats cryopreservation coconut water extender electroejaculation epididymis cats

Abstract in Portuguese:

O objetivo deste trabalho foi avaliar a qualidade espermática de gatos domésticos obtidos por eletroejaculação e recuperação da cauda do epidídimo após a refrigeração a -1°C e a 4°C por 24 e 48 horas. Vinte e nove gatos adultos (2 a 6kg) foram utilizados. A colheita de espermatozoides foi realizada por eletroejaculação (EEJ) e, após 48 horas, os gatos foram orquiectomizados, e as amostras espermáticas foram obtidas a partir do ducto deferente e da cauda do epidídimo (EPD). As amostras foram diluídas em ACP-117® e as características espermáticas foram avaliadas em três momentos distintos: fresco, 24 e 48 horas após a refrigeração. Para ser possível comparar as duas temperaturas de refrigeração, a primeira etapa foi analisar se havia diferença entre as técnicas de colheita. Após isto, dois experimentos foram conduzidos: no primeiro, espermatozoides de 14 gatos foram utilizados e a refrigeração foi realizada a -1°C; e no segundo, amostras de 15 gatos foram utilizados e os espermatozoides foram refrigerados a 4°C. A cinética espermática foi avaliada por análise computadorizada (CASA), a concentração por câmara de Neubauer, a morfologia espermática foi avaliada pela coloração de Karras modificada, e a integridade da membrana foi avaliada por eosina nigrosina. Os resultados obtidos foram analisados no software R, versão 3.2.5, utilizando o teste de Mann-Whitney para variáveis com distribuições anormais, considerando significância ao nível de 5%. No ejaculado, maiores valores de defeitos morfológicos totais foram observados após 24 e 48 horas de refrigeração a 4°C (P<0,022) em comparação com refrigeração a -1°C, usando o teste de Friedman. Para quantificar a diminuição na qualidade espermática, as reduções dos parâmetros foram calculadas entre os pontos de tempo (F-24h/F-48h/24h-48h). Na EPD, uma maior redução na qualidade espermática foi detectada após 24 horas de refrigeração a 4°C, tanto na motilidade e na cinética espermática quanto nos índices de movimento e velocidade, em comparação com a refrigeração a -1°C. Com base nos resultados, pode concluir-se que a refrigeração dos espermatozoides felino a -1°C, até 48 horas, foi eficaz na manutenção da qualidade espermático colhidos por EEJ e EPD, e pode ser uma alternativa para a criopreservação de espermatozoides em felinos domésticos.

• Refrigeração espermatozoides gatos domésticos criopreservação diluente de água de coco eletroejaculação epidídimo

Abstract in English:

ABSTRACT.- Ravagnani G.M., Torres M.A., Leal D.F., Martins S.M.M.K., Papa F.O., Dell’Aqua Junior J.A., Alvarenga M.A. & Andrade A.F.C. 2018. Cryopreservation of boar semen in 0.5mL straws at low spermatozoa concentration is better than high concentration to maintain sperm viability. [A manutenção da viabilidade do sêmen suíno criopreservado em palhetas de 0,5mL em baixas concentrações espermáticas é melhor do que em altas concentrações.] Pesquisa Veterinária Brasileira 38(9):1726-1730. Núcleo de Pesquisa em Suínos, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, Pirassununga, SP 13635-900, Brazil. E-mail: andrefc@usp.br To date, no studies have been performed evaluating the effect of boar spermatozoa concentration in 0.5mL freezing straws, leading us to examine this question. Each sperm&#8209;rich fraction of the ejaculate (n=25) was diluted at five different sperm concentrations (100, 200, 300, 600 and 800 x 106 spermatozoa/mL), packaged in 0.5mL straws, and subsequently frozen. After thawing, the sperm from all of treatment groups were analyzed to determine motility characteristics using a sperm class analyzer (SCA-CASA), and their plasma and acrosomal membrane integrity, mitochondrial membrane potential, sperm membrane lipid peroxidation and fluidity were analyzed by flow cytometry. An increase in spermatozoa concentration above 300x106 spermatozoa/mL in a 0.5mL straw impaired (p<0.05) the total and progressive motility, curvilinear velocity, straight-line velocity, linearity and beat cross frequency. However, the plasma and acrosomal membrane integrity, mitochondrial membrane potential, membrane lipid peroxidation and fluidity were not influenced (p>0.05) by high spermatozoa concentrations at freezing. Therefore, to increase spermatozoa survival and total and progressive motility after thawing, boar spermatozoa should be frozen at concentrations up to 300x106 spermatozoa/mL.

• Cryopreservation boar semen spermatozoa concentration sperm viability cryoinjury cryocapacitation swine Sêmen suíno criopreservão crioinjúria concentração espermática criocapacitação suíno

Abstract in Portuguese:

RESUMO.- Ravagnani G.M., Torres M.A., Leal D.F., Martins S.M.M.K., Papa F.O., Dell’Aqua Junior J.A., Alvarenga M.A. & Andrade A.F.C. 2018. Cryopreservation of boar semen in 0.5mL straws at low spermatozoa concentration is better than high concentration to maintain sperm viability. [A manutenção da viabilidade do sêmen suíno criopreservado em palhetas de 0,5mL em baixas concentrações espermáticas é melhor do que em altas concentrações.] Pesquisa Veterinária Brasileira 38(9):1726-1730. Núcleo de Pesquisa em Suínos, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, Pirassununga, SP 13635-900, Brazil. E-mail: andrefc@usp.br Até o momento, não foram realizados estudos que avaliassem o efeito da concentração de espermatozoides/mL em palhetas (0,5mL) para a criopreservação, levando-nos a analisar esta questão. Cada fração-rica do ejaculado (n=25) foi diluída em cinco diferentes concentrações de espermatozoides (100, 200, 300, 600 e 800x106 espermatozoides/mL), envasadas em palhetas de 0,5mL e posteriormente congeladas. Após a descongelação, os espermatozoides de todos os tratamentos foram avaliados a fim de determinar as características de motilidade usando um sistema de análise computadorizada dos espermatozoides (SCA-CASA). A integridade das membranas plasmática e acrosomal, o potencial de membrana mitocondrial, a peroxidação lipídica e a fluidez da membrana foram analisadas por citometria de fluxo. O aumento na concentração de espermatozoides acima de 300x106 espermatozoides/mL diminuiu (p<0,05) a motilidade total e progressiva, velocidade curvilínea, velocidade linear, linearidade e frequência de batimento. No entanto, a integridade da membrana plasmática e acrosomal, potencial de membrana mitocondrial, peroxidação lipídica e fluidez de membrana não foram influenciados (p>0,05) por altas concentrações de espermatozoides durante a criopreservação. Portanto, a fim de melhorar a sobrevivência dos espermatozoides suínos e a motilidade total e progressiva após a descongelação, os espermatozoides suínos devem ser congelados a concentrações não superiores a 300x106 espermatozoides/mL.

Abstract in English:

In the study effect of cholesterol was evaluated on the sperm quality of Nordestina stallion breed. Twenty semen samples were used from two stallions, diluted with BotuSemen extender and cholesterol add as follows: control, 0.75mg of cholesterol-loaded cyclodextrin (CLC) and 1.0mg of CLC/120x106 sperm/mL, and incubated for 15 min at 22°C. The samples were diluted 1:5 with lactose-yolk egg extender and cooled to 5°C over two hours, loaded into 0.5mL straws and frozen in static liquid nitrogen vapor before being plunged into nitrogen. Samples were thawed (37°C/30s) and analyzed. The variables were analyzed by ANOVA and means compared by Tukey test (P<0.05). Higher percentages of total and progressive motile was higher for sperm treated with CLC compared to control, and CLC promoted higher percentages (P<0.05) of total and progressive motility for the 3 hours of incubation. The percentage of viability and plasma membrane integrity of spermatozoa were higher (P<0.05) in sperm treated with CLC compared to the control group. The number of spermatozoa reacted to hypoosmotic test was higher (P<0.05) in sperm treated with CLC than control. Addition of CLC in the semen of Nordestina stallion breed improve the sperm quality after cryopreservation.

• Cholesterol cyclodextrin cryopreservation stallation sperm horses Equus caballus longevity motility plasma membrane viability

Abstract in Portuguese:

Nesta pesquisa avaliou-se o efeito do colesterol sobre o sêmen de garanhões da raça Nordestina sobre a qualidade espermática. Vinte ejaculados de dois garanhões foram diluídos com BotuSemen e colesterol carreado pela ciclodextrina (CCC) adicionado no sêmen: controle, 0,75mg de CCC e 1,0mg de CCC/120x106 sptz/mL, e incubado a 26°C/15min. O sêmen foi diluído 1:5 (v/v) com diluente Lactose-gema de ovo e resfriado a 5°C/2h, envasado em palhetas de 0,5mL, e acondicionado sob vapor de nitrogênio líquido, e depois imersos. As amostras foram descongeladas (37 °C/30s) e avaliadas. As variáveis foram avaliadas com ANOVA e teste de Tukey (P<0,05). A motilidade total e progressiva foi maior (P<0,05) no sêmen tratado com CCC comparado as amostras do grupo controle, e CCC promoveu maior percentual (P<0,05) de motilidade total e progressiva durante as 3 horas de incubação. A percentagem de espermatozoides com viabilidade e integridade foi maior (P<0,05) no sêmen tratado com CCC (81,47 e 86,07%) comparado ao controle (72,12 e 70,19%). O número de espermatozoides reativos ao teste hiposmótico foi maior (P<0,05) nas amostras de sêmen tratadas com CCC comparado ao controle. Adição de colesterol no sêmen de garanhões Nordestino melhora a qualidade espermática apos a criopreservação.

• Colesterol ciclodextrina criopreservação espermatozoides garanhões equinos Equus caballus membrana plasmática motilidade longevidade viabilidade

Abstract in English:

ABSTRACT.- Oberlender G., Ruiz López S., De Ondiz Sánchez A.D., Vieira L.A., Pereira M.B., Silva L.F., Zangeronimo M.G. & Murgas L.D.S. 2016. In vitro fertilization of porcine oocytes is affected by spermatic coincubation time. Pesquisa Veterinária Brasileira 36(Supl.1):58-64. Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Sul de Minas, Campus Muzambinho, Estrada de Muzambinho Km 35, Bairro Morro Preto, Cx Postal 2, Muzambinho, MG 37890-000, Brazil. E-mail: guilherme.oberlender@muz.ifsuldeminas.edu.br The aim was to study the effects of different gamete coincubation times on porcine in vitro fertilization (IVF), and to verify whether efficiency could be improved by reducing oocyte exposure time to spermatozoa during IVF. In groups of 50, a total of 508 immature cumulus-oocyte complexes (COCs) were matured in NCSU-37 medium. The COCs were cultured for 44 hours and then inseminated with in natura semen (2,000 spermatozoa/oocyte). The sperm and oocytes were coincubated according to the following treatments (T): T1 = oocytes exposed to spermatozoa for one hour (173 oocytes), T2 = oocytes exposed to spermatozoa for two hours (170 oocytes), and T3 = oocytes exposed to spermatozoa for three hours (165 oocytes). After these coincubation periods, the oocytes were washed in fertilization medium (TALP medium) to remove spermatozoa not bound to the zona pellucida and cultured in another similar medium (containing no sperm). Eighteen to twenty hours after fertilization, the putative zygotes were stained in Hoechst-33342 to evaluate the IVF results. The penetration rate was higher (P<0.05) after two hours of coincubation time than it was for one or three hours. Furthermore, 68.60% of the ova coincubated with the spermatozoa for two hours were monospermic. The oocytes exposed to spermatozoa for one hour (T1) presented a higher (P<0.01) rate of polyspermy than those in T2 and T3. Fertilization performance (%) did not differ (P>0.05) between oocytes exposed to spermatozoa for one (T1) and three hours (T3). However, optimum (P=0.048) results were obtained after two hours of coincubation, when the rate of fertilization performance was 50.16±8.52%. The number of penetrated sperm per oocyte, as well as male pronucleus formation, did not differ (P>0.05) between the treatments evaluated. Under these assay conditions, especially in relation to the sperm concentration used, gamete coincubation for a period of two hours appears to be optimal for monospermy and fertilization performance. Thus, it is the optimal time period for obtaining a large number of pig embryos capable of normal development.

• Fertilization oocyte pig fertilização ovócito suíno

Abstract in Portuguese:

RESUMO.- Oberlender G., Ruiz López S., De Ondiz Sánchez A.D., Vieira L.A., Pereira M.B., Silva L.F., Zangeronimo M.G. & Murgas L.D.S. 2016. In vitro fertilization of porcine oocytes is affected by spermatic coincubation time. [A fertilização in vitro de ovócitos suínos é afetada pelo tempo de coincubação espermático.] Pesquisa Veterinária Brasileira 36(Supl.1):58-64. Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Sul de Minas, Campus Muzambinho, Estrada de Muzambinho Km 35, Bairro Morro Preto, Cx Postal 2, Muzambinho, MG 37890-000, Brazil. E-mail: guilherme.oberlender@muz.ifsuldeminas.edu.br Esse estudo foi realizado para avaliar os efeitos de diferentes tempos de coincubação dos gametas sobre a fertilização in vitro (FIV) de suínos e se a eficiência dessa técnica poderia ser melhorada pela redução no período que os ovócitos são expostos aos espermatozoides durante a FIV. Um total de 508 (em grupos de 50) complexos cumulus-ovócito (COCs) imaturos foram maturados no meio NCSU-37. Os COCs foram cultivados por 40-44 horas e então inseminados com sêmen in natura (2.000 espermatozoides/ovócito). Os espermatozoides e ovócitos foram coincubados de acordo com os seguintes tratamentos (T): T1 = ovócitos expostos aos espermatozoides por uma hora (173 ovócitos); T2 = ovócitos expostos aos espermatozoides por duas horas (170 ovócitos) e T3 = ovócitos expostos aos espermatozoides por três horas (165 ovócitos). Após esses períodos de coincubação, os ovócitos foram lavados em meio de fertilização (meio TALP) para remoção dos espermazoides não ligados a zona pelúcida e cultivados em outro mesmo meio (não contendo espermatozoides). Após 18-20 horas de fertilização, os prováveis zigotos foram corados com Hoechst-33342 para avaliação dos resultados da FIV. A taxa de penetração foi maior (P<0,05) após o tempo de coincubação de duas horas em comparação a uma e três horas. Além disso, 68,60% dos ovócitos coincubados com os espermatozoides por duas horas foram monospérmicos. Os ovócitos expostos aos espermatozoides por uma hora (T1) apresentaram elevada (P<0,01) taxa de polispermia em comparação com o T2 e T3. A eficiência da fertilização (%) não diferiu (P>0,05) entre os ovócitos expostos aos espermatozoides por uma (T1) e três horas (T3). Entretanto, ótimos (P=0,048) resultados foram obtidos após duas horas de coincubação, quando a taxa da eficiência da fertilização foi 50,16 ± 8,52%. O número de espermatozoides penetrados por ovócito e a formação de pro-núcleo masculino não diferiu (P>0,05) entre os tratamentos avaliados. Sob as condições de ensaio realizadas, especialmente em relação à concentração espermática utilizada, a coincubação dos gametas por um período de duas horas parece ser ótima para as taxas de monospermia e eficiência da fertilização. Portanto, um tempo provavelmente ótimo para obter um elevado número de embriões suínos capazes de ter um desenvolvimento normal.

Abstract in English:

ABSTRACT.- Simões L.S., Rici R.E.G., Favaron P.O., Sasahara T.H.C., Barreto R.S.N., Borghesi J. & Miglino M.A. 2016. Ultrastructural analysis of the spermatogenesis in the guinea pig (Cavia porcellus). Pesquisa Veterinária Brasileira 36(Supl.1):89-94. Departamento de Cirurgia, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, Av. Prof. Dr. Orlando Marques de Paiva 87, Cidade Universitária, São Paulo, SP 05508-270, Brazil. E-mail: phelipe.favaron@yahoo.com.br Understanding of the reproductive function is essential for both, the establishment of appropriate management systems, and for the use of new species as animal models. In this study, we used light and electron microscopy to characterize the sexual development stages of the guinea pig (Cavia porcellus) in specimens of 30, 45 and 90 days of age. We observed the differentiation of spermatocytes only through transmission electron microscopy in the leptotene, zygotene and pachytene phases of meiosis, in 30-day-old animals. During puberty, there was differentiation of the germinative epithelium and formation of the acrosome. Spermatozoa, however, were not detected. Thus, we could infer that puberty happens after 45 days of age. Sexual maturity was evident in 90-day-old specimens. Our results showed that changes in the testicular germinative epithelium during the postnatal sexual development in guinea pig led to morphological changes, including the ones related to the development of Leydig and Sertoli cells, which are directly related to puberty. In this work, we provide new morphological subsidies for a better understanding of reproductive parameters of this species, enabling its use as an animal model in the field of the reproductive biology.

• Reproduction guinea pig reprodução porquinho-da-índia

Abstract in Portuguese:

RESUMO.- Simões L.S., Rici R.E.G., Favaron P.O., Sasahara T.H.C., Barreto R.S.N., Borghesi J. & Miglino M.A. 2016. Ultrastructural analysis of the spermatogenesis in the guinea pig (Cavia porcellus). [Análise ultraestrutural da espermatogênese do porquinho-da-Índia (Cavia porcellus).] Pesquisa Veterinária Brasileira 36(Supl.1):89-94. Departamento de Cirurgia, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, Av. Prof. Dr. Orlando Marques de Paiva 87, Cidade Universitária, São Paulo, SP 05508-270, Brazil. E-mail: phelipe.favaron@yahoo.com.br A função reprodutiva é um fator de vital compreensão tanto para o estabelecimento de sistemas apropriados de manejo, quanto para o uso de novas espécies como modelos animais. Neste estudo através da microscopia de luz e eletrônica caracterizou-se a fase de desenvolvimento sexual do porquinho-da-Índia (Cavia porcellus) em espécimes de 30, 45 e 90 dias de desenvolvimento. Nos animais de 30 dias, a diferenciação dos espermatócitos foi visualizada somente na microscopia eletrônica de transmissão em leptóteno, zigóteno e paquíteno. Durante a puberdade, houve diferenciação do epitélio germinativo, formação do acrossoma, porém não foram evidenciados espermatozóides, assim, infere-se que a puberdade acontece a partir dos 45 dias de idade. A maturidade sexual foi evidente aos 90 dias de idade. Nossos resultados mostraram que ao longo do desenvolvimento sexual pós-natal do porquinho-da-Índia, mudanças no epitélio germinativo testicular levam há alterações morfológicas, inclusive com relação ao desenvolvimento das células de Sertoli e de Leydig, as quais estão diretamente relacionadas com a puberdade. Assim, novos subsídios morfológicos são fornecidos para um melhor entendimento dos parâmetros reprodutivos desta espécie, a fim de viabilizar sua utilização como modelo animal no campo da biologia reprodutiva.

Abstract in English:

ABSTRACT.- Freneau G.E., Carvalho S.F.M., Saboia-Morais S.M.T. & Freneau B.N. 2016. Aspects of spermatogenesis and microscopic testicular morphology in Greater Rhea, Rhea americana (Linnaeus, 1758). Pesquisa Veterinária Brasileira 36(10):1045-1052. Laboratório de Andrologia e Tecnologia do Sêmen, Escola de Veterinária e Zootecnia, Universidade Federal de Goiás, Campus Samambaia, Av. Esperança s/n, Campus Universitário, Goiânia, GO 74690-900, Brazil. E-mail: gfreneau@gmail.com The purpose of this study was to study the microscopic morphology of the testicular parenchyma of Rhea americana birds. Fifty-four 2.5±0.5 year-old male adults bred in captivity. were used. During commercial slaughter, samples of testis were collected in November/2005, December/2006 and May/2007, in order to compare possible differences. The samples underwent optical microscopy analysis and measurements of seminiferous tubule (ST) total diameters, lumen, epithelium thickness and the relative volume of parenchyma. The ST had circular form in transverse cross sections. November/2005 and December/2006 samples had many types of germinative cells and spermatozoa in lumen, but in May/2007 the samples of epithelium were poor regarding meiotic and mitotic pictures, and it was difficult to find any spermatozoon; in many tubules the lumen was inexistent or diminished. In December/2006 and May/2007 the averages were: tubule diameter 110.3 and 5.3mµ, lumen 52.4 and 4.5mµ, epithelium thickness 57.8 and 0.7mµ respectively. The volumetric proportions were: seminiferous epithelium 75.6 and 75.9, cysts in epithelium 2.1 and 1.0, ST 93.3 and 84.0, interstitium 6.2 and 15.6 respectively. The sperm reserves were: 19.7±2 and 0±0 x109 sperm cells in December 2006 and May 2007 respectively. Microscopic measures of seminiferous tubules, spermatic cells and diameter of the nuclei were presented. These data confirm reproductive seasonality, with breeding season in spring-summer with sperm production. A great variation n parenchyma, when compared breeding was noticeable.

• Spermatogenesis testicle greater rhea Rhea americana reproduction

Abstract in Portuguese:

RESUMO.- Freneau G.E., Carvalho S.F.M., Saboia-Morais S.M.T. & Freneau B.N. 2016. Aspects of spermatogenesis and microscopic testicular morphology in Greater Rhea, Rhea americana (Linnaeus, 1758). [Aspectos da espermatogênese e morfologia microscópica testicular em Emas, Rhea americana (Linnaeus, 1758).] Pesquisa Veterinária Brasileira 36(10):1045-1052. Laboratório de Andrologia e Tecnologia do Sêmen, Escola de Veterinária e Zootecnia, Universidade Federal de Goiás, Campus Samambaia, Av. Esperança s/n, Campus Universitário, Goiânia, GO 74690-900, Brazil. E-mail: gfreneau@gmail.com O objetivo do estudo foi estudar a morfologia microscópica do parênquima testicular de emas (Rhea americana). Foram utilizados 54 machos adultos criados em cativeiro de 2,5±0,5 anos de idade. Durante o abate comercial foram coletadas amostras de testículos em novembro/2005, dezembro/2006 e maio/2007, para efeitos de comparação. As amostras foram processadas e para microscopia ótica de rotina para análise. Foram medidas diâmetro total de túbulos seminíferos (ST), lúmen, espessura do epitélio e a proporção volumétrica dos componentes do parênquima. O ST apresentou forma circular nas seções transversais. Em novembro/2005 e dezembro/2006, se observaram os tipos de células germinativas e espermatozoides no lúmen. Em maio/2007, as amostras de epitélio se observaram escassas meioses e imagens de mitose e era difícil de ver qualquer espermatozoide, em muitos dos túbulos o lúmen era inexistentes ou diminuído de tamanho. Em dezembro/2006 e maio/2007, as médias das características estudadas foram: diâmetro dos túbulos 110,3 e 5,3 mµ, lúmen 52,4 e 4,5mµ, espessura do epitélio 57,8 e 0,7mµ, respectivamente. As proporções volumétricas foram: epitélio seminífero 75,6 e 75,9, cistos no epitélio 2,1 e 1,0, túbulos seminíferos 93,3 e 84,0, interstício 6,2 e 15,6, respectivamente. Foram apresentadas medidas microscópicas de túbulos seminíferos, diâmetro dos núcleos das espermátides. Estes dados confirmam a sazonalidade reprodutiva, com época de reprodução na primavera - verão, com a produção de esperma. Foi perceptível uma grande variação nas medidas do parênquima testicular, quando se comparou a estação reprodutiva.

Abstract in English:

ABSTRACT.- Sousa P.C., Santos E.A.A., Silva A.M., Bezerra J.A.B., Souza A.L.P., Lima G.L., Oliveira M.F. & Silva A.R. 2016. Identification of ultrastructural and functional damages in sperm from six-banded armadillos (Euphractus sexcinctus) due to cryopreservation. Pesquisa Veterinária Brasileira 36(8):767-774. Laboratory of Animal Germoplasm Conservation, Universidade Federal Rural do Semi-Árido, BR-110 Km 47, Presidente Costa e Silva, Mossoró, RN 599625-900, Brazil. E-mail: legio2000@yahoo.com The aim of the study was to cryopreserve the semen of six-banded armadillos (Euphractus sexcinctus) in Tris-yolk and glycerol diluent, and to determine the damage caused by the freezing-thawing process, using fluorescent markers and ultrastructural analysis. Semen samples (n=11) collected from 4 adult six-banded armadillos by electroejaculation were cryopreserved in Tris diluent plus 20% egg yolk and 3% glycerol, in a fast freezing curve. Classical analysis of samples was performed after dilution, refrigeration and thawing, followed by fluorescence analysis, using a combination of fluorescent probes to assess membrane integrity (propidium iodide - PI and Hoechst - H342), and mitochondrial activity (CMXRos - Mito Tracker Red®). We also used the ultrastructural analysis to verify possible morphological alterations caused by cryoinjuries. When compared with fresh samples, we verified a significant decline in all the armadillos’ semen parameters after thawing, in which only 6.1% motile sperm were found. However, the percentage of sperm which remained with viable (13%) and functional (24.7%) membranes after thawing suggests that some cells could be live but immotile. Analysis using fluorescent markers revealed that the mitochondria of armadillos’ sperm is highly sensible to the freezing protocol and the findings through ultrastructure analysis proved this statement. Additionally, the images obtained by transmission electron microscopy revealed that frozen-thawed sperm presented damaged plasma membrane, nuclear modifications as changes in chromatin and acrossomal changes relative to sperm capacitation. In conclusion, this study is the first attempt to cryopreserve the semen of an armadillo species, and to help us to identify critical points on the freezing-thawing procedure in order to improve the protocol.

• Sperm armadillo Euphractus sexcinctus cryopreservation semen mitochondrial tatu-peba criopreservação sêmen mitocondria

Abstract in Portuguese:

RESUMO.- Sousa P.C., Santos E.A.A., Silva A.M., Bezerra J.A.B., Souza A.L.P., Lima G.L., Oliveira M.F. & Silva A.R. 2016. Identification of ultrastructural and functional damages in sperm from six-banded armadillos (Euphractus sexcinctus) due to cryopreservation. [Identificação de danos ultraestruturais e funcionais em espermatozoides de tatus-peba (Euphractus sexcinctus) oriundos da criopreservação.] Pesquisa Veterinária Brasileira 36(8):767-774. Laboratory of Animal Germoplasm Conservation, Universidade Federal Rural do Semi-Árido, BR-110 Km 47, Presidente Costa e Silva, Mossoró, RN 599625-900, Brazil. E-mail: legio2000@yahoo.com O objetivo deste estudo foi criopreservar o sêmen de tatus-peba (Euphractus sexcinctus) em diluente Tris-gema e glicerol, e determinar os danos causados pelo processo de congelação-descongelação, utilizando marcadores fluorescentes e análise ultraestrutural. As amostras de sêmen (n=11) coletadas de 4 tatus-peba adultos por eletroejaculação foram criopreservadas em diluente Tris acrescido de 20% de gema de ovo e 3% de glicerol, em curva rápida de congelação. A análise clássica das amostras foi realizada após a diluição, refrigeração e descongelação, seguida por análise de fluorescência, utilizando uma combinação de sondas fluorescentes para avaliar a integridade da membrana (Iodeto de Propídio - PI e Hoechst - H342), e a atividade mitocondrial (CMXRos - Mito Tracker RED®). Foi também utilizada a análise ultraestrutural para verificar possíveis alterações morfológicas causadas pela crioinjúria. Quando comparadas com as amostras a fresco, verificou-se uma queda significativa em todos os parâmetros seminais dos tatus após a descongelação, em que apenas 6,1% de espermatozoides móveis foram encontrados. No entanto, o percentual de espermatozoides que permaneceu com membrana viável (13%) e funcional (24,7%) após a descongelação sugere que algumas células podem estar vivas, mas imóveis. Análises utilizando marcadores fluorescentes revelaram que as mitocôndrias dos espermatozoides de tatus são altamente sensíveis ao protocolo de congelação e os achados através da análise ultraestrutural comprovaram esta afirmação. Além disso, as imagens obtidas por microscopia eletrônica de transmissão revelaram que espermatozoides congelados-descongelados apresentaram membranas plasmáticas danificadas, modificações nucleares como alterações na cromatina, e alterações acrossomais relativas à capacitação espermática. Em conclusão, este estudo é a primeira tentativa de criopreservação de sêmen em uma espécie de tatu, e nos auxiliou a identificar pontos críticos no processo de congelação-descongelação, a fim de melhorar o protocolo.

Abstract in English:

ABSTRACT.- Souza W.L., Moraes E.A., Costa J.M.S., Souza P.H.F., Lopes Junior E.S., Oliveira R.P. & Toniolli R. 2016. [Effect of different concentrations of melatonin to ram spermatozoa on oxidative stress after cryopreservation.] Efeito de diferentes concentrações de melatonina em espermatozoides de carneiros sobre estresse oxidativo após criopreservação. Pesquisa Veterinária Brasileira 36(7):657-664. Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal, Fundação Universidade Federal do Vale do São Francisco, Rodovia 407 Km 12, Lote 543, Projeto Nilo Coelho C1, Petrolina, PE 56300-000, Brazil. E-mail: wilde@zootecnista.com.br The aim was to evaluate the effect of adding different concentrations of melatonin in ram semen diluted after cryopreservation. Ten ejaculates were collected0 from three adult ram (n=30) by means of artificial vagina for sheep. The collected samples were diluted in Tris-egg yolk, to a final concentration 200x106 sptz/mL kept in water bath at 32°C, and melatonin added as treatments: control; 100pM; 100nM; 100&#956;M and 1mM melatonin. Then, the samples were cooled in a cold chamber at 5°C for two hours, in straws of 0.5mL and sealed. They were stored under the liquid nitrogen vapor for 15 minutes to 8cm of liquid blade and frozen with liquid nitrogen. Samples were analyzed for sperm motility, membrane integrity, acrosomal membrane, mitochondrial activity, oxidative stress and quantification of the binding capacity. The variables were subjected to analysis of variance and the means were compared by Tukey test at 5% probability. The total and progressive motility of thawed sperm were higher in samples treated with 100pM melatonin (62.99 and 45.07%, respectively; P<0.05) when compared to other treatments. The addition of different concentrations of melatonin in semen diluted with the exception of 1mM concentration, a higher percentage of cells with intact plasma membrane, as compared with the control (P<0.05). The percentage of sperm with acrosome membrane integrity was higher in the semen with 100pM melatonin (P<0.05) than the other treatments. The high mitochondrial activity was higher in spermatozoa treated with 100pM melatonin (69.30%; P<0.05). Addition of 100nM melatonin reduced the amount of TBARS after cryopreservation (2.84, P<0.05) when compared with the other treatments. After thawing, the number of sperm which bind to the perivitelline membrane was higher in the melatonin treated with 100pM (155,73; P<0.05). Therefore, melatonin addition the semen diluted can be useful to enhance the cryopreservation of sheep semen, improving fertilization rates through artificial insemination.

• Melatonin antioxidant freezing spermatozoa stress melatonina congelamento

Abstract in Portuguese:

RESUMO.- Souza W.L., Moraes E.A., Costa J.M.S., Souza P.H.F., Lopes Junior E.S., Oliveira R.P. & Toniolli R. 2016. [Effect of different concentrations of melatonin to ram spermatozoa on oxidative stress after cryopreservation.] Efeito de diferentes concentrações de melatonina em espermatozoides de carneiros sobre estresse oxidativo após criopreservação. Pesquisa Veterinária Brasileira 36(7):657-664. Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal, Fundação Universidade Federal do Vale do São Francisco, Rodovia 407 Km 12, Lote 543, Projeto Nilo Coelho C1, Petrolina, PE 56300-000, Brazil. E-mail: wilde@zootecnista.com.br Objetivou-se avaliar o efeito da adição de diferentes concentrações de melatonina no sêmen diluído de carneiros após criopreservação. Foram coletados 10 ejaculados de três carneiros adultos (n=30), por meio de vagina artificial para ovinos. Os ejaculados coletados foram diluídos em Tris-Gema de ovo, para a concentração final de 200x106 sptz/mL, mantidos em banho maria a 32°C, e a melatonina adicionada conforme os tratamentos: Controle; 100pM; 100nM; 100&#956;M e 1mM de melatonina. Então, as amostras foram resfriadas em câmara fria a 5°C por duas horas, envasadas em palhetas de 0,5 mL e lacradas. Logo após, foram acondicionadas sob vapores do nitrogênio liquido, por 15 minutos, a 8cm da lâmina líquida e congeladas com nitrogênio líquido. As amostras foram analisadas quanto à motilidade espermática, integridade da membrana plasmática, membrana acrossomal, atividade mitocondrial, quantificação do estresse oxidativo e a capacidade de ligação. As variáveis foram submetidas à análise de variância e as médias foram comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. A motilidade total e progressiva dos espermatozoides descongelados foi maior nas amostras tratadas com 100pM de melatonina (62,99 e 45,07% respectivamente; P<0,05) quando comparado aos demais tratamentos. A adição das diferentes concentrações de melatonina no sêmen diluído, com exceção da concentração de 1 mM, apresentou maior percentual de células com membrana plasmática íntegra, quando comparadas com o controle (P<0,05). O percentual de espermatozoides com integridade da membrana do acrossoma foi maior no sêmen tratado com 100 pM de melatonina (P<0,05) do que nos demais tratamentos. A alta atividade mitocondrial foi maior nos espermatozoides tratados com 100 pM de melatonina (69,30%; P<0,05). A adição de 100 nM de melatonina reduziu a quantidade de TBARS após a criopreservação (2,84; P<0,05) quando comparado aos demais tratamentos. Após o descongelamento, o número de espermatozoides que se ligaram à membrana perivitelina foi maior nos tratados com 100 pM de melatonina (155,73; P<0,05). Portanto, a adição de melatonina no sêmen diluído pode ser útil para aperfeiçoar a criopreservação do sêmen de ovinos, melhorando as taxas de fertilização por meio da inseminação artificial.

Abstract in English:

ABSTRACT.- Rodrigues R.T.G.A., Santos J.R.S., Azerêdo L.M.S., Rocha E.F., Carvalho M.A.M., Portal M.J.I.D., Sousa O. B. & Menezes D.J.A. 2016. Influence of scrotal bipartition on spermatogenesis yield and Sertoli cell efficiency in sheep. Pesquisa Veterinária Brasileira 36(4):258-262. Unidade Acadêmica de Medicina Veterinária, Centro de Saúde e Tecnologia Rural, Universidade Federal de Campina Grande, Avenida Universitária s/n, Santa Cecília, Patos, PB 58708-110, Brazil. E-mail: mdanayres@gmail.com With the objective to assess the effect of scrotal bipartition on spermatogenesis in sheep, the testes were used from 12 crossbred rams of sheep farms in the municipality of Patos, Paraíba, Brazil, distributed into two groups: GI with six rams with scrotal bipartition, and GII with six rams without scrotal bipartition. The testicular biometry was measured and the testes were collected, fixed in Bouin and fragments were processed to obtain histological slides. The spermatogenesis yield and the Sertoli cell efficiency was estimated by counting the cells of the spermatogenetic line at stage one of the seminiferous epithelium cycle and the Sertoli cells. The results were submitted to analysis of variance with the ASSISTAT v.7.6 program and the mean values were compared by the Student-Newman-Keuls test (SNK) at 5% significance. The testicular biometric parameters did not show statistical difference (p>0.05) between the groups. The meiotic, spermatogenetic and Sertoli cell efficiency were higher in bipartitioned rams (p<0.05), while the mitotic yield did not differ (p>0.05) between GI and GII. The results indicated that there is superiority in the spermatogenetic parameters of bi-partitioned rams, suggesting that these sheep present, as reported in goats, indication of better reproductive indices.

• Scrotal bipartition spermatogenesis Sertoli cells bipartição escrotal espermatogênese células de Sertoli

Abstract in Portuguese:

RESUMO.- Rodrigues R.T.G.A., Santos J.R.S., Azerêdo L.M.S., Rocha E.F., Carvalho M.A.M., Portal M.J.I.D., Sousa O. B. & Menezes D.J.A. 2016. Influence of scrotal bipartition on spermatogenesis yield and Sertoli cell efficiency in sheep. [Influência da bipartição escrotal sobre o rendimento da espermatogênese e eficiência das células de Sertoli em ovinos.] Pesquisa Veterinária Brasileira 36(4):258-262. Unidade Acadêmica de Medicina Veterinária, Centro de Saúde e Tecnologia Rural, Universidade Federal de Campina Grande, Avenida Universitária s/n, Santa Cecília, Patos, PB 58708-110, Brazil. E-mail: mdanayres@gmail.com Com o objetivo de avaliar o efeito da bipartição escrotal sobre a espermatogênese em ovinos, foram utilizados os testículos de 12 ovinos sem raça definida oriundos de criadouros do município de Patos-PB, Brasil, distribuídos em dois grupos, GI de seis animais com bipartição escrotal e o GII de seis animais sem bipartição escrotal. Realizou-se a aferição da biometria testicular, em seguida, os testículos foram coletados, fixados em Bouin e fragmentos foram processados para obtenção de lâminas histológicas. Foi estimado o rendimento da espermatogênese e eficiência das células de Sertoli contando-se as células da linhagem espermatogênica no estádio I do Ciclo do Epitélio Seminífero, bem como as células de Sertoli. Os resultados foram submetidos à análise de variância pelo programa ASSISTAT v.7.6 e os valores médios foram comparados pelo teste Student-Newman-Keuls (SNK) a 5% de significância. Os parâmetros de biometria testicular não apresentaram diferença estatística (p>0,05) entre os grupos. Os rendimentos meiótico, espermatogênico e a eficiência das células de Sertoli mostraram-se superiores em animais bipartidos (p<0,05), enquanto o rendimento mitótico não diferiu (p>0,05) entre GI e GII. Os resultados indicaram existir superioridade nos parâmetros espermatogênicos de ovinos bipartidos, sugerindo que estes animais apresentam, assim como constatado em caprinos, indicativo de melhores índices reprodutivos.

Abstract in English:

ABSTRACT.- Costa S.F., Nogueira J.C., Soares B.A., Ambrósio N.A., Chaves A.S., Melo L.Q. & Zangeronimo M.G. 2015. [Morphology of scrotum and testicle, and spermatic pathways of Metachirus nudicaudatus (Geoffroy, 1803), Didelphidae-Marsupialia.] Morfologia do escroto, do testículo e das vias espermáticas de Metachirus nudicaudatus (Geoffroy, 1803), Didelphidae-Marsupialia. Pesquisa Veterinária Brasileira 35(Supl.1):69-83. Setor de Morfologia Animal, Departamento de Medicina Veterinária, Universidade Federal de Lavras, Campus UFLA, Lavras, MG 37200-000, Brazil. E-mail: sfcosta@dmv.ufla.br Gonads and sperm pathways of five adult male Metachirus nudicaudatus in the reproductive phase were used to describe the morphology of scrotum, testicle, and spermatic tract. M. nudicaudatus has a scrotum pre-penis which contains the testicles permanently. The scrotal skin is not pigmented and has few hairs and glands. The parietal vaginal tunic is slightly pigmented. The testicles are oval and connected to the epididymis by testicular-epididymal pedicle; they are surrounded externally by the testicular capsule and supported by a stroma of connective nature. Interstitial cells are the predominant elements in abundant intertubular tissue. The seminiferous tubules are wide, meandering and surrounded by a fibro-elastic coat, containing myoid cells. The seminiferous epithelium is composed of spermatogenic cells and Sertoli cells interspersed. The seminiferous tubules converge toward the end of the testis capitata, getting coated only support cells, featuring a transition region between the seminiferous tubules and straight tubules, occupied by a type “valve” structure that partially blocks the tubular lumen. Straight tubules together to form a single efferent ductule, which runs a small intra-testicular extent, penetrates through the tunica and the pedicle testis-epididymis. The flexuosa part of the efferent ductule forms a separate lobe in the medial part of the body of the epididymis. The epididymis is enveloped by a capsule and epididymal comprising the epididymal duct, which is quite entangled. The epididymal duct is lined by pseudostratified columnar epithelium with simple principal, basal, apical and “clear halo” cells. The main cells are prevalent and have morphological and histochemical differing characteristics along the duct, enabling to characterize nine different epididymal areas. In the lumen of the seventh area (top of tail) that starts the pairing of sperm. This phenomenon coincides well with morphological change and a larger amount of neutral muco-substances is secreted in that area. Vas deferens has three parts: fair-epididymal, abdominal and funicular part, based on histological and histochemical changes of the epithelium and surrounding components. The vas deferens has no bulb and even crosses the ureter before flowing into the urethra. The spermatic cord contains the vas deferens, testicular artery and veins, lymphatic vessels, nerves and developed cremaster muscle. Its components have structural changes in the proximal, middle and distal region, with a peculiar admirable network.

• Scrotum testicle Metachirus nudicaudatus epididymis escroto testículo epidídimo

Abstract in Portuguese:

RESUMO.- Costa S.F., Nogueira J.C., Soares B.A., Ambrósio N.A., Chaves A.S., Melo L.Q. & Zangeronimo M.G. 2015. [Morphology of scrotum and testicle, and spermatic pathways of Metachirus nudicaudatus (Geoffroy, 1803), Didelphidae-Marsupialia.] Morfologia do escroto, do testículo e das vias espermáticas de Metachirus nudicaudatus (Geoffroy, 1803), Didelphidae-Marsupialia. Pesquisa Veterinária Brasileira 35(Supl.1):69-83. Setor de Morfologia Animal, Departamento de Medicina Veterinária, Universidade Federal de Lavras, Campus UFLA, Lavras, MG 37200-000, Brazil. E-mail: sfcosta@dmv.ufla.br Foram utilizadas as gônadas e vias espermáticas de cinco animais machos, adultos em fase reprodutiva, da espécie Metachirus nudicaudatus Geoffroy 1803, única espécie do gênero, para descrever a morfologia do escroto, do testículo e das vias espermáticas. O Metachirus possui escroto pré-peniano e que contém os testículos permanentemente. A pele escrotal é não pigmentada e com poucos pelos e glândulas. A lâmina parietal da túnica vaginal apresenta-se pouco pigmentada. Os testículos são ovais e ligados ao epidídimo através do pedículo testículo-epididimário. Eles são envolvidos, externamente, pela cápsula testicular e sustentados por um estroma de natureza conjuntiva. As células intersticiais são os elementos predominantes no abundante tecido intertubular. Os túbulos seminíferos são largos, enovelados e envolvidos por uma túnica própria fibroelástica, contendo células mióides. O epitélio seminífero é formado pelas células espermatogênicas e de Sertoli intercaladas. Os túbulos seminíferos convergem em direção à extremidade capitata do testículo, ficando revestidos por apenas células de sustentação, caracterizando uma região de transição entre túbulos seminíferos e túbulos retos, ocupada por uma estrutura tipo “válvula” que obstrui parcialmente o lume tubular. Os túbulos retos reúnem-se para formar um único dúctulo eferente, que percorre uma pequena extensão intratesticular, atravessa a albugínea e penetra no pedículo testículo-epididimário. A parte flexuosa do dúctulo eferente forma um lóbulo separado na parte medial do corpo do epidídimo. O epidídimo é envolvido pela cápsula epididimária e constituído pelo ducto epididimário, que se encontra bastante enovelado. O ducto epididimário é revestido por epitélio simples colunar pseudoestratificado apresentando células principais, basais, apicais e de “halo claro”. As células principais são predominantes e apresentam características morfológicas e histoquímicas que diferem ao longo do ducto, possibilitando a caracterização de nove diferentes zonas epididimárias. É no lume da zona sete (início da cauda) que começa o pareamento de espermatozoides. Esse fenômeno coincide com alterações morfológicas bem evidentes e uma maior quantidade de mucossubstâncias neutras é secretada nessa zona.O ducto deferente apresenta-se dividido em três partes: justa-epididimária, funicular e abdominal, baseando nas variações histológicas e histoquímicas de seu epitélio e componentes envolventes. O ducto deferente não apresenta ampola e nem cruza o ureter antes de desembocar na uretra. O funículo espermático contém o ducto deferente, artéria e veias testiculares, vasos linfáticos, nervos e um desenvolvido músculo cremáster. Seus componentes apresentam modificações estruturais nas regiões proximal, média e distal, sendo notável a peculiar rede admirável.