Resultado da pesquisa (5)

Termo utilizado na pesquisa cloning

#1 - Cloning and expression of Neospora caninum rhoptry 2 and its potential as an immunobiological for neosporosis control

Abstract in English:

The protozoan Neospora caninum is known worldwide as one of the main causes of abortion in cattle. During infection, rhoptry proteins present in the apical complex of the parasite play important roles in adhesion and parasitophorous vacuole formation. The use of N. caninum ROP2 in experimental vaccines has shown promising protective results. In our study we performed cloning and expression in Escherichia coli of an antigenic portion of N. caninum ROP2. The recombinant protein (rROP2) was obtained in insoluble form, and the purified protein showed a size of approximately 18kDa. Even being a small truncate NcROP2 region, it was possible to conserve the antigenic epitopes which were recognized by bovine serum naturally infected with N. caninum. Vaccination with rROP2 on aluminum hydroxide adjuvant induced high levels of rROP2-specific IgG antibodies capable of recognizing native protein in tachyzoite lysates. In conclusion, our approaches were effective in obtaining the rROP2 protein, which induced specific mouse immune response and was also recognized by sera from N. caninum naturally infected cattle. These results suggest that it is a promising antigen for the development of neosporosis subunit vaccines as well as a suitable antigen for use in immunodiagnosis.

Abstract in Portuguese:

O protozoário Neospora caninum é conhecido mundialmente como uma das principais causas de aborto em bovinos. Durante a infecção, as proteínas rhoptry presentes no complexo apical do parasita desempenham papel importante na adesão e formação de vacúolos parasitóforos. O uso de ROP2 de N. caninum em vacinas experimentais tem mostrado resultados de proteção promissores. Em nosso estudo, realizamos a clonagem e expressão em Escherichia coli de uma porção antigênica de N. caninum ROP2. A proteína recombinante (rROP2) foi obtida na forma insolúvel, e a proteína purificada apresentou tamanho aproximado de 18kDa. Mesmo sendo uma pequena região truncada de NcROP2, foi possível conservar os epítopos antigênicos que foram reconhecidos pelo soro de bovinos naturalmente infectados com N. caninum. A vacinação com rROP2 adsorvida no adjuvante de hidróxido de alumínio induziu altos níveis de anticorpos IgG anti-rROP2, capazes de reconhecer a proteína nativa em lisados ​​de taquizoítos. Em conclusão, nossas abordagens foram eficazes na obtenção da proteína rROP2, que induziu resposta imune específica em camundongos e também foi reconhecida por soros de bovinos naturalmente infectados com N. caninum. Estes resultados sugerem que rROP2 é um antígeno promissor para o desenvolvimento de vacinas de subunidades de neosporose, bem como um antígeno adequado para uso em imunodiagnóstico.


#2 - Epigenetic characterization of the H19/IGF2 locus in calf clones placenta

Abstract in English:

Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT-Cloning) is a promising technique in many areas and is based on genetically identical individuals. However, its efficiency is low. Studies suggest that the leading cause is inadequate epigenetic reprogramming. This study aimed to characterize the methylation pattern of the exon 10 regions of the IGF2 gene and the Imprinting Control Region (ICR) of the H19 gene in the placenta of cloned calves. For this study, female and male cloned calves presenting different phenotypes were used. Genomic DNA from these animals’ placenta was isolated, then treated with sodium bisulfite and amplified to the ICR/H19 and IGF2 loci. PCR products were cloned into competent bacteria and finally sequenced. A significant difference was found between controls and clones with healthy phenotypes for the ICR/H19 region. In this region, controls showed a hemimethylated pattern, as predicted in the literature due to this region has an imprinted control, while clones were showed less methylated. For the IGF2, no significant differences were found between controls and clones. These results suggest that different genomic regions in the genome may be independently reprogrammed and that failures in reprogramming the DNA methylation patterns of imprinted genes may be one of the causes of the low efficiency of SCNT.

Abstract in Portuguese:

A Transferência Nuclear de Células Somáticas (TNCS-Clonagem) é uma técnica promissora em várias áreas, e se baseia na produção de indivíduos geneticamente idênticos. No entanto, sua eficiência é baixa. Estudos sugerem que a principal causa seja uma reprogramação epigenética inadequada. O objetivo desse trabalho é caracterizar o padrão de metilação da região éxon 10 do gene IGF2 e da Região Controladora de Imprinting (ICR) do gene H19 na placenta de bezerros clonados. Para a execução do trabalho foram selecionados clones bovinos fêmeas e machos, apresentando diferentes fenótipos. O DNA da placenta desses animais foi extraído, e em seguida foi tratado com bissulfito de sódio e amplificado para os loci ICR/H19 e IGF2. Os produtos da PCR foram clonados em bactérias competentes e, por fim, sequenciados. Foi encontrada uma diferença significativa entre os controles e os clones com fenótipos saudáveis para a região da ICR/H19. Nesta região, os controles tiveram um padrão hemimetilado, como previsto pela literatura, devido essa região ser imprinted. Enquanto os clones encontravam-se menos metilados. Para a região do éxon 10 do IGF2, não foi encontrada diferença significativa entre controles e clones. Estes resultados sugerem que as diferentes regiões do genoma podem se reprogramar independente umas das outras e que falhas na reprogramação do padrão de metilação do DNA de genes imprinted podem ser uma das causas da baixa eficiência da TNCS.


#3 - Clinical and blood gas analysis of calves conceived by artificial insemination, in vitro fertilization and animal cloning

Abstract in English:

In order for successful extra-uterine adaptation to occur, it is necessary for the neonate to be able to establish its respiratory functions effectively, guaranteeing efficient oxygenation and good vitality. Respiratory disorders are the major cause of death during the neonatal period in cattle, and this mortality is even more significant when it comes to calves originated by in vitro fertilization (FIV) or animal cloning (CA). Blood gas analysis assesses acid-base balance changes effectively, and when associated with the neonate’s clinical examination, provides subsidies for accurate diagnosis and early treatment of neonatal maladaptation. The objective of this study was to study neonates born from artificial insemination (IA) and to compare them to calves conceived by FIV and CA, regarding blood gas and clinical examination. For that, 20 AI calves, 15 FIV calves, and 15 cloned calves were evaluated immediately after calving and at 6, 12, 24 and 48 hours of life. At all experimental times, venous blood samples were collected for blood gas and clinical examination was performed. In the postpartum evaluation, Apgar score and column length and respiratory amplitude measurements were used. IVF animals showed no alterations, resembling Group IA calves. The calves from CA showed more pronounced acidosis postpartum than expected physiological acidosis mixed for neonates, with decreasing values ​​of bicarbonate (HCO3-), and base excess (BE) and the increase in carbon dioxide pressure (PCO2) when compared to the other groups. This disorder may have reflected lower mean values ​​of Apgar scores and increased heart and respiratory rates. Intensive follow-up of these neonates is suggested, with monitoring by clinical and hemogasometric examination for early diagnosis of this condition and treatment based on oxygen therapy and bicarbonate replacement

Abstract in Portuguese:

Para que ocorra adaptação extra-uterina bem sucedida é necessário que o neonato consiga estabelecer suas funções respiratórias de maneira eficaz, garantindo oxigenação eficiente e boa vitalidade. Distúrbios respiratórios são os maiores causadores de óbito durante o período neonatal em bovinos, e essa mortalidade é ainda mais expressiva quando se trata de bezerros originados por fertilização in vitro (FIV) ou clonagem animal (CA). A hemogasometria avalia alterações do equilíbrio ácido-básico de forma eficaz, e quando associada ao exame clínico do neonato, fornece subsídios para diagnóstico acurado e tratamento precoce da má adaptação neonatal. O objetivo deste trabalho foi estudar recém-nascidos bovinos originados por inseminação artificial (IA) e compará-los a bezerros concebidos por FIV e CA, no que se refere a hemogasometria e exame clínico. Para isso, foram utilizados 20 bezerros IA, 15 bezerros FIV e 15 bezerros clonados que foram avaliados imediatamente após o parto e com 6, 12, 24 e 48 horas de vida. Em todos os momentos experimentais foram colhidas amostras de sangue venoso para hemogasometria e foi realizado o exame clínico. Na avaliação pós-parto foram utilizados escore Apgar e mensurações de comprimento de coluna e amplitude respiratória. Os animais FIV não demonstraram alterações, assemelhando-se aos bezerros do Grupo IA. Os bezerros provenientes de CA apresentaram acidose pós-parto mais acentuada do que a acidose mista fisiológica esperada para neonatos, evidenciada pela diminuição dos valores de bicarbonato (HCO3-) e excesso de bases (EB) e pelo aumento de pressão parcial de dióxido de carbono (PCO2) quando comparados aos demais grupos. Esse distúrbio pode ter refletido em valores médios menores de escore Apgar e no aumento das frequências cardíaca e respiratória. Sugere-se acompanhamento intensivo desses neonatos, com monitoramento por meio do exame clínico e hemogasométrico para diagnóstico precoce dessa condição e tratamento baseado em oxigenioterapia e reposição de bicarbonato.


#4 - Selection, characterization and cloning of the fljB and groEL genes agonists of the innate immune system pattern recognition receptors of birds, 34(3):217-223

Abstract in English:

ABSTRACT.- Soares B.A., Ságio S.A., Peconick A.P., Barrios P.R., Chalfun-Júnior A., Costa G.M., Barçante J.M. & Martins N.R.S. 2014. [Selection, characterization and cloning of the fljB and groEL genes agonists of the innate immune system pattern recognition receptors of birds.] Seleção, caracterização e clonagem dos genes fljB e groEL agonistas dos receptores de reconhecimento de padrão do sistema imune inato das aves. Pesquisa Veterinária Brasileira 34(3):217-223. Setor de Medicina Veterinária Preventiva, Departamento de Medicina Veterinária, Universidade Federal de Lavras, Campus UFLA, Lavras, MG 37200-000, Brazil. E-mail: brunoantunes.soares@yahoo.com.br The recombinant production of innate immune system pattern recognition receptor agonists has provided a new tool for the production of immunostimulants for animals. The molecular pattern associated with the pathogen (PAMP), flagellin, coded by the fljB gene from Salmonella Typhimirium, and the molecular pattern associated to the damage (DAMP), HSP60, coded by the groEL gene from S. Typhimurium and S. Enteritidis, are recognized by pattern recognition receptors (PRRs) of the innate immune system of birds. In the present study, we performed the cloning of genetic fragments of the genes fljB, from S. Typhimurium, and groEL from S. Typhimurium and S. Enteritidis inserted in expression vector pET100/D-TOPO and transformed in E. coli TO10 cells. The clones were evaluated by colony PCR, plasmidial DNA PCR and genome sequencing in order to confirm the presence of these genes. In the colony PCR, we identified the presence of genes groEL (S. Enteritidis), groEL (S. Typhimurium) and fljB (S. Typhimurium) in 80%, 60% and 80% of the transformed colonies, respectively. The cloning system adopted allowed the production of HSP60 genetic fragment clones and flagellin of Salmonella strains, allowing the posterior use of these clones in gene expression trials, with the future potential of being used as non-specific immunostimulants for birds.

Abstract in Portuguese:

RESUMO.- Soares B.A., Ságio S.A., Peconick A.P., Barrios P.R., Chalfun-Júnior A., Costa G.M., Barçante J.M. & Martins N.R.S. 2014. [Selection, characterization and cloning of the fljB and groEL genes agonists of the innate immune system pattern recognition receptors of birds.] Seleção, caracterização e clonagem dos genes fljB e groEL agonistas dos receptores de reconhecimento de padrão do sistema imune inato das aves. Pesquisa Veterinária Brasileira 34(3):217-223. Setor de Medicina Veterinária Preventiva, Departamento de Medicina Veterinária, Universidade Federal de Lavras, Campus UFLA, Lavras, MG 37200-000, Brazil. E-mail: brunoantunes.soares@yahoo.com.br A produção recombinante de agonistas dos receptores do reconhecimento de padrão do sistema imune inato tem fornecido uma nova ferramenta para a produção de imunoestimulantes para animais. O padrão molecular associado ao patógeno (PAMP), flagelina, codificado pelo gene fljB de Salmonella Typhimurium e o padrão molecular associado ao dano (DAMP) HSP60, codificado pelo gene groEL da S. Typhimurium e S. Enteritidis, são reconhecidos por receptores de reconhecimento de padrões (RRPs) do sistema imune inato das aves. No presente estudo, foi feita a clonagem de fragmentos genéticos dos genes fljB de S. Typhimurium e groEL de S. Typhimurium e S. Enteritidis inseridos no vetor de expressão pET100/D-TOPO e transformados em células de E. coli TOP10. Os clones foram avaliados pela PCR de colônia, PCR de DNA plasmidial e sequenciamento genômico para a confirmação da presença desses genes. Na PCR de colônia, foram identificadas em 80%, 60% e 80% das colônias transformadas, a presença dos genes groEL (S. Enteritidis), groEL (S. Typhimurium) e fljB (S. Typhimurium) respectivamente. O sistema de clonagem adotado possibilitou a produção de clones dos fragmentos genéticos da HSP60 e flagelina das cepas de Salmonella, permitindo a utilização posterior desses clones em ensaios de expressão gênica, com potencial futuro de serem utilizados como imunoestimulante inespecífico das aves.


#5 - Insights on bovine genetic engineering and cloning, 33(Supl.1):113-118

Abstract in English:

ABSTRACT.- Bressan F.F, Sangalli J.R., Pessôa L.V.F., Pires P.R.L. & Meirelles F.V. 2013. Insights on bovine genetic engineering and cloning. Pesquisa Veterinária Brasileira 33(Supl.1):113-118. Departamento de Medicina Veterinária, Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos, Universidade de São Paulo, Av. Duque de Caxias Norte 225, Pirassununga, SP 13635-900, Brazil. E-mail: fabianabressan@usp.br Transgenic technology has become an essential tool for the development of animal biotechnologies, and animal cloning through somatic cell nuclear transfer (SCNT) enabled the generation of genetically modified animals utilizing previously modified and selected cell lineages as nuclei donors, assuring therefore the generation of homogeneous herds expressing the desired modification. The present study aimed to discuss the use of SCNT as an important methodology for the production of transgenic herds, and also some recent insights on genetic modification of nuclei donors and possible effects of gene induction of pluripotency on SCNT.

Abstract in Portuguese:

RESUMO.- Bressan F.F, Sangalli J.R., Pessôa L.V.F., Pires P.R.L. & Meirelles F.V. 2013. Insights on bovine genetic engineering and cloning. [Experiências em clonagem e transgenia em bovinos.] Pesquisa Veterinária Brasileira 33(Supl.1):113-118. Departamento de Medicina Veterinária, Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos, Universidade de São Paulo, Av. Duque de Caxias Norte 225, Pirassununga, SP 13635-900, Brazil. E-mail: fabianabressan@usp.br Tecnologias de modificação genética têm se tornado ferramentas essenciais para o desenvolvimento de biotecnologias animais. A clonagem animal mediante transferência nuclear de célula somática (TNCS) possibilitou a geração de animais geneticamente modificados através da utilização de linhagens celulares previamente modificadas e selecionadas como doadoras de núcleo, garantindo desta maneira a geração de rebanhos homogênoes expressando a modificação desejada. O presente estudo objetivou discutir o uso da TNCS como importante metodologia para a produção de rebanhos transgênicos, assim como experiências recentes na manipulação genética de células doadoras de núcleo e possíveis efeitos da indução gênica à pluripotência na TNCS.


Colégio Brasileiro de Patologia Animal SciELO Brasil CAPES CNPQ UNB UFRRJ CFMV