PESQUISA VETERINÁRIA BRASILEIRA

Abstract in English:

ABSTRACT.- Holsback L., Pena H.F.J., Ragozo A., Lopes E.G., Gennari S.M. & Soares R.M. 2012. Serologic and molecular diagnostic and bioassay in mice for detection of Toxoplasma gondii in free range chickens from Pantanal of Mato Grosso do Sul. Pesquisa Veterinária Brasileira 32(8):721-726. Setor de Veterinária e Produção Animal, Universidade Estadual do Norte do Paraná, Campus Luiz Meneghel, Rodovia BR 369 Km 54, Bandeirantes, PR 86360-000, Brazil. E-mail: lhsfertonani@uenp.edu.br The aim of this study was to investigate the occurrence of Toxoplasma gondii and compare the results obtained in the Modified Agglutination Test (MAT), Polimerase Chain Reaction (PCR) and bioassay in mice. In order to accomplish this, 40 free-range chickens from eight farms in neighboring areas to the Pantanal in Nhecolândia, Mato Grosso do Sul, were euthanized and blood samples, brain and heart were collected. The occurrence of anti-T. gondii antibodies found in chickens was 67.5% (27 samples), considering as a cutoff point the dilution 1:5. Among the samples analyzed, 7 (25.9%) were positive in the dilution 1:5, 3 (11.1%) in 1:10, 2 (7.4%) in 1:20, 3 (11.1%) in 1:320, 1 ( 3.7%) in 1:640, 3 (11.1%) in 1:1280, 2 (7.4%) in 1:2560, 4 (14.8%) in 1:5120 and 2 (7.4%) in 1:10.240. From the mixture of tissue samples (brain and heart) from the chickens analyzed, 16 (40%) presented electrophoretic bands compatible with T. gondii by PCR (gene B1). In the comparison of techniques, 59.26% positivity in PCR was revealed among animals that were seropositive in MAT (cutoff 1:5). From 141 inoculated mice, six (4.44%) died of acute toxoplasmosis between 15 and 23 days after inoculation. Surviving mice were sacrificed at 74 days after inoculation, and a total of 28 cysts were found in the brains of 10 distinct groups. From the seropositive hens, 27 bioassays were performed and 11 (40.7%) isolates were obtained. A greater number of isolations happened in mice that were inoculated with tissues from chickens that had high titers for anti-T. gondii antibodies. Chronic infection in mice was observed in nine groups (33.3%) from five different properties. Among the surviving mice, 25.6% were positive for T. gondii in MAT (1:25). From mice positive in PCR, 87.5% were also positive in MAT. Among the PCR-negative mice, 5.2% were positive for T. gondii in MAT. It can be concluded through this study that the occurrence of infecton by T. gondii in the rural properties studied was high, that PCR directed to gene B1 does not confirm the viability of the parasite, but it can be used as a screening method for the selection of chickens infected by T. gondii, that the animals with titer greater than 10 must be prioritized for the selection of animals for bioassay, since for them, the chances of isolating the parasite are greater and that seroconversion in experimentally infected mice is not a good indicator for isolating the agent.

• Toxoplasma gondii Toxoplasmosis Toxoplasmose

Abstract in Portuguese:

RESUMO.- Holsback L., Pena H.F.J., Ragozo A., Lopes E.G., Gennari S.M. & Soares R.M. 2012. Serologic and molecular diagnostic and bioassay in mice for detection of Toxoplasma gondii in free range chickens from Pantanal of Mato Grosso do Sul. Pesquisa Veterinária Brasileira 32(8):721-726. Setor de Veterinária e Produção Animal, Universidade Estadual do Norte do Paraná, Campus Luiz Meneghel, Rodovia BR 369 Km 54, Bandeirantes, PR 86360-000, Brazil. E-mail: lhsfertonani@uenp.edu.br Os objetivos deste estudo foram investigar a ocorrência de Toxoplasma gondii e comparar os resultados obtidos no Teste de Aglutinação Modificada (MAT), Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) e o bioensaio em camundongos. Para tanto, 40 galinhas de criação livre de oito fazendas em áreas limítrofes ao Pantanal da Nhecolândia, Mato Grosso do Sul, foram eutanasiadas e amostras de sangue, o cérebro e o coração foram coletados. A frequência de anticorpos anti-T. gondii encontrada nas galinhas foi de 67,5% (27 amostras), considerando como ponto de corte a diluição 1:5. Entre as amostras analisadas, 7 (25,9%) foram positivas na diluição 1:5, 3 (11,1%) em 1:10, 2 (7,4%) em 1:20, 3 (11,1%) em 1:320, 1 ( 3,7%) em 1:640, 3 (11,1%) em 1:1.280, 2 (7,4%) em 1:2.560, 4 (14,8%) em 1:5.120 e 2 (7,4%) em 1:10.240. A partir da mistura de amostras de tecidos (cérebro e coração) das galinhas analisadas, 16 (40%) apresentaram bandas eletroforéticas compatíveis com T. gondii por PCR (gene B1). Na comparação das técnicas, revelou-se 59,26% de positividade na PCR entre os animais soropositivos no MAT (ponto de corte 1:5). Dos 141 camundongos inoculados, seis (4,44%) morreram de toxoplasmose aguda entre 15 e 23 dias após a inoculação. Os camundongos que sobreviveram foram sacrificados 74 dias após a inoculação, sendo encontrados 28 cistos nos cérebros de 10 grupos distintos. Das galinhas soropositivas, foram realizados 27 bioensaios e obtidos 11 (40,7%) isolados. Um maior número de isolamentos ocorreu em camundongos que foram inoculados com tecidos de galinhas que tinham altos títulos de anticorpos anti-T. gondii. Infecção crônica em camundongos foi observada em nove grupos (33,3%) de cinco propriedades diferentes. Entre os camundongos que sobreviveram, 25,6% foram positivos para T. gondii no MAT (1:25). Dos camundongos positivos na PCR, 87,5% também foram positivos no MAT. Já entre os camundongos PCR negativos 5,2% foram positivos para T. gondii no MAT. Concluiu-se através deste estudo que a ocorrência de infecção pelo T. gondii nas propriedades rurais estudadas foi alta, que a PCR direcionada ao gene B1, não confirma a viabilidade do parasita, porém pode ser utilizada como método de triagem para a seleção de galinhas infectadas por T. gondii, que os animais com título maior que 10 devem ser priorizados para a seleção de animais para bioensaio, pois para eles, as chances de isolamento do parasita são maiores e que a soroconversão em camundongos infectados experimentalmente não é um bom indicador de isolamento do agente.

Abstract in English:

ABSTRACT.- Marinho M., Langoni H., Oliveira S.L., Carreira R., Perri, S.H.V. e Luvizoto M.C. 2002. [Humoral iminune response, bacterial recovery and time lesions in mice geneticaly selected for high and low antibody production and in outbreed Balb/c mice face to Leptospira interrogans sorovar icterohaemorrhagiae.] Resposta humoral, recuperação bacteriana e lesões histológicas em camundongos geneticamente selecionados para bons e maus produtores de anticorpos e Balb/c, frente à infecção por Leptospira interrogans sorovar icterohaemorrhagiae. Pesquisa Veterinária Brasileira 23(1):5-12. Laboratório de Microbiologia, Departamento de Apoio, Produção e Saúde Animal FOA, Unesp-Campus de Araçatuba, Cx. Postal 341, Araçatuba, SP 16050-680, Brazil. The aim of the present work was to evaluate the association among the kinetics of humoral immune response, the recovery ofviable leptospiras and the intensity ofthe tissue lesions in mice selected for high (H) and low (L) production of antibodies (selection N-A) and in mice from the outbreed Balb/c Iine, inoculated with pathogenic Leptospira interrogans serovar icterohaemorrhagiae. Toe H and L lines showed modifications in some steps ofthe immune response, mainly in relation to the macrophagic activity, representing extreme phenotypes found in heterogeneous natural populations. Mice were sacrificed in eight moments after the infection. Analysis of the results revealed that from the 7th day after the infection, on Iine H mice presented antibodies titles significantly higher as compared to the L line mice, maintaining the multispecific effect Balb/c tine mice showed intermediàte results between the two Iines. Antibodies production worked as a timiting factor to the infection, becausewhen a greater leptospiras recovery was obtained, at the initial phase of the infection, the titles of antibodies were elevated. Inflammatory and degenerative process led to similar lesions in the organs ofinfected mice. Only a variation in the degree oftissue compromising was observed according to the tine. H tine mice showed more extensive lesions than L and Balb/c lines mice. For the Balb/c tine mice, the lesions were moderate. As a mie, H and Balb/c mice lines showed a Th2 profile of immune response, with higher indexes of antibody production and gravity ofthe lesions, while L line mice presented a Th 1 profile ofimmune response.

• Leptospirosis humoral immune response bacterial recovery lesions mice genetically selected Balb/c Leptospirose recuperação bacteriana lesões resposta humoral camundongos geneticamente selecionados.

Abstract in Portuguese:

RESUMO.- Marinho M., Langoni H., Oliveira S.L., Carreira R., Perri, S.H.V. e Luvizoto M.C. 2002. [Humoral iminune response, bacterial recovery and time lesions in mice geneticaly selected for high and low antibody production and in outbreed Balb/c mice face to Leptospira interrogans sorovar icterohaemorrhagiae.] Resposta humoral, recuperação bacteriana e lesões histológicas em camundongos geneticamente selecionados para bons e maus produtores de anticorpos e Balb/c, frente à infecção por Leptospira interrogans sorovar icterohaemorrhagiae. Pesquisa Veterinária Brasileira 23(1):5-12. Laboratório de Microbiologia, Departamento de Apoio, Produção e Saúde Animal FOA, Unesp-Campus de Araçatuba, Cx. Postal 341, Araçatuba, SP 16050-680, Brazil. O presente trabalho teve por finalidade associar a cinética da resposta humoral à recuperação de leptospiras viáveis e à intensidade das lesões teciduais em camundongos geneticamente selecionados para bons (High) e maus (Low) produtores de anticorpos (seleção IV-A), além de camundongos outbreed, Balb/c, inoculados com amostra patogênica de Leptospira interrogans sorovar icterohaemorrhagiae. As linhagens High e Low (seleção IV-A) apresentam modificações em alguns compartimentos da resposta imune, principalmente em relação à atividade macrofágica, representando fenótipos extre mos encontrados em populações naturais heterogêneas. Os camundongos foram sacrificados em oito momentos após a infecção. A análise dos resultados revelou que a partir do 7º dia após a infecção, os camundongos da linhagem High apresentaram elevação nos títulos de anticorpos estatisticamente significantes quando comparados aos camundongos da linhagem Low, mantendo assim o efeito multiespecífico. Os camundongos Balb/c apresentaram resultados intermediários entre as duas linhagens. A produção de anticorpos colaborou como fator limitante à infecção, pois quando obtevese maior recuperação de leptospiras, na fase inicial da infecção, os títulos de anticorpos encontravam-se em elevação. As lesões observadas nos órgãos de camundongos infectados consistiram basicamente nos mesmos processos inflamatórios e degenerativos, que não se alteraram, variando apenas o grau de comprometimento tecidual, de acordo com a linhagem. A linhagem high apresentou lesões mais extensas que as apresentadas pelas linhagens low e Balb/c, sendo que nesta última as lesões foram moderadas. De forma geral a linhagem High e Balb/c apresentaram um perfil de resposta Th2, com o maior índice de produção de anticorpos e gravidade das lesões, enquanto a linhagem Low apresentou um perfil de resposta Th 1.

Abstract in English:

ABSTRACT.- Monteavaro, C.E., Soto P., Echevarría H.M., Catena M.C., Portiansky E.L. & Gimeno E.J. 2000. Immunohistochemical detection of Tritrichomonas foetus in experimentally infected mice. [Detecção imunohistoquímica de Tritrichomonas foetus em camundongos experimentalmente infectados.] Pesquisa Veterinária Brasileira 20(1):43-46. Institute of Pathology, Veterinary School, UNLP, P.O.Box 296, 1900 La Plata, Argentina. The need to intensify knowledge of the pathogenesis of bovine genital trichomoniasis (BGT) led to the use ofalternative animal models such as the mouse. Nevertheless, it is necessary to elucidate the dynamics of the infection in this animal species, evaluating different stages of the colonization and evolution of the pathological alterations. The immunohistochemistry (IHC) of fers advantages over the routine histopathological staining techniques for the detection of the protozoan in tissues, cellular detritus and inside the macrophages. The goal of the present study was to demonstrate the presence of Tritrichomonas foetus in the reproductive tract of infected mice using an IHC technique. Female BALB/c mice were infected with a suspension of T. foetus by intravaginal route, in the estrum phase, detected by exfoliative vaginal cytology. After 10 weeks, the animais were sacrificed; uterus and vagina were fixed and histologically processed. Some slides were stained with HE. The rest of the slides were processed for IHC. An immunoadsorbed polyclonal serum against T. foetus was used. The. avidine-biotine technique (HistoMouse, Zymed ™) was employed. The histopathological studies showed a dilation of the uterine glands, presence of macrophages in the lumen of the organ and inner part of the endometrial glands. No T. foetus was identified tísing this method. The IHQ allowed additionally the identification of the protozoan in the endometrium, endometrial glands, uterine lumen and inside neutrophils and macrophages. The cytological studies stained with IHC showed either isolated T. foetus adhered to epithelial cells or inside macrophages. This technique proves to be a useful tool for the study of the pathogenesis of bovine genital trichomoniasis (BGT) in an experimental model.

• Tritrichomonas foetus bovine genital trichomoniasis immunohistochemistry mouse tricomoníase genital bovina imunohistoquímica camundongo.

Abstract in Portuguese:

RESUMO.- Monteavaro, C.E., Soto P., Echevarría H.M., Catena M.C., Portiansky E.L. & Gimeno E.J. 2000. Immunohistochemical detection of Tritrichomonas foetus in experimentally infected mice. [Detecção imunohistoquímica de Tritrichomonas foetus em camundongos experimentalmente infectados.] Pesquisa Veterinária Brasileira 20(1):43-46. Institute of Pathology, Veterinary School, UNLP, P.O.Box 296, 1900 La Plata, Argentina. A necessidade de aumentar o conhecimento da patogenia da tricomoníase genital bovina (BGT) conduziu ao uso de modelos experimentais alternativos como o camundongo. Não obstante, é necessário elucidar a dinâmica da infecção nesta espécie e avaliar as diferentes fases da colonização e evolução das alterações patológicas. A imunohistoquí-mica (IHQ) oferece vantagens sobre as técnicas histoquímicas de rotina para a observação do protozoário em tecidos, detritos celulares e dentro de macrófagos. O objetivo do presente trabalho foi demonstrar pelo uso de uma técnica de IHQ a presença de Tritrichomonas foetus no sistema reprodutivo de camundongos infectados. Camundongos BALB/c fêmeas foram infectados pela via intravaginal, com uma suspensão de T. foetus, na fase de estro, detectado com citologia exfoliativa vaginal. Depois de 10 semanas, os animais foram sacrificados; útero e vagina forma fixados e processados para histologia. Alguns cortes foram corados com HE. O restante dos cortes foi processado para IHQ. Foi usado um soro policlonaf imunoadsorvído anti-T.foetus. A técnica de avidina biatina (HistoMouse, Zymed™) foi empregada. Os estudos histopatológicos mostraram uma dilatação das glândulas uterinas, presença de macrófagos no lúmen do órgão e parte interna das glândulas endometriais. T. foetus não foi identificado por esse método. A IHQ permitiu identificar as mesmas lesões observadas e a presença do protozoário no endométrio, nas glândulas endometriais, no lúmen uterino e dentro de neutrófilos e macrófagos. O estudo citológico em lâminas coradas por IHQ, mostrou T.foetus aderido a células epiteliais, ou dentro de macrófagos. Esta técnica demonstra ser uma ferramenta útil para o estudo da patogenia da tricomoníase genital bovina (BGT) utilizando-se o camundongo como modelo experimental.

Abstract in English:

ABSTRACT.- Menegucci E.A., Dutra I.S. & Döbereiner J. 1998. [Toxicological sensitivity and specificity of the micro-complement fixation test for the detection of botulinum toxins C and D in culture medium and liver of mice.] Sensibilidade toxicológica e especificidade do teste de microfixação de complemento na detecção de toxinas botulínicas C e D em meio de cultura e fígado de camundongo. Pesquisa Veterinária Brasileira 18(2):47-52. Depto Apoio, Produção e Saúde Animal, Unesp-Campus de Araçatuba, Cx. Postal 533, Araçatuba, SP 16015-050, Brazil. The toxicological sensitivity and specificity of the micro-complement fixation test (MCF) for the detection of botulinum toxins C and D were studied in supernatants of the bacterial cultures and in livers of mice inoculated with lethal and sublethal doses. Botulinum toxins C and D were produced in Hemoline culture medium, titered through the determination of LD50 by the mouse test and adjusted to dilutions of 10, 1, 0.1, 0.01 and 0.001 LD50 Two experimental models were used to determine the toxicological sensitivity of MCF in the supernatant of the culture medium with the dilutions described, and also in liver extracts of mice weighing 20 g and inoculated with the same dilutions. Detection of the botulinum toxins was attempted in liver extracts of mice which had received lethal doses of the respective toxins, and in others which had been inoculated with sublethal doses and were sacrificed in intervals of 5 days. The results show that the toxicological sensitivity of MCF, regarding the two types of toxins at the level of 0.001 LD50, was 100% when the supernatants of the culture medium were tested; this means that the sensitivitywas 100 times higher than with the mouse test. The toxicological sensitivity of MCF in the liver extracts of mice inoculated with 1 and 10 LD50 of botulinum toxins C and D was inferior, giving values of 100, 80, 89 and 72% respectively. By this test it was also possible to detect botulinum toxins type C and D in liver extracts of mice inoculated with sublethal doses, up to 15 days after the injection. The specificity of MCF was 88% and 92%, when liver extracts of healthy contral mice were tested and when challenged with antitoxins C and D; and 100% when challenged with the supernatant of the culture medium. These results indicate that MCF could be of importance for research and could substitute in vivo tests.

• Botulinum toxins micro-complement fixation test sensitivity specificity mouse test Toxinas botulínicas microfixação de complemento sensibilidade especificidade camundongo.

Abstract in Portuguese:

RESUMO.- Menegucci E.A., Dutra I.S. & Döbereiner J. 1998. [Toxicological sensitivity and specificity of the micro-complement fixation test for the detection of botulinum toxins C and D in culture medium and liver of mice.] Sensibilidade toxicológica e especificidade do teste de microfixação de complemento na detecção de toxinas botulínicas C e D em meio de cultura e fígado de camundongo. Pesquisa Veterinária Brasileira 18(2):47-52. Depto Apoio, Produção e Saúde Animal, Unesp-Campus de Araçatuba, Cx. Postal 533, Araçatuba, SP 16015-050, Brazil. No presente estudo pretendeu-se verificar a sensibilidade toxicológica e especificidade do Teste de Microfixação de Complemento (MCF) na detecção de toxinas botulínicas C e D no sobrenadante de cultivas bacterianos e em fígados de camundongos inoculados com doses letais e subletais. As toxinas foram produzidas em meio de cultura Hemoline, tituladas através da determinação da DL50 pelo Bioensaio em Camundongo e diluídas nas concentrações de 10, 1, 0, 1, 0,01 e 0,001 DL50. Desta forma, foram utilizadas em dois modelos experimentais, onde foi determinada a sensibilidade toxicológica do MCF no sobrenadante do meio de cultura com as diluições descritas acima e ainda em extratos hepáticos de camundongos com peso corporal de 20g, inoculados com as mesmas diluições. A tentativa de evidenciação das toxinas botulínicas nos extratos hepáticos de camundongos foi realizada através da sua extração após a morte pela administração das doses letais e ainda pelo sacrifício dos animais inoculados -com doses subletais, em intervalos de 5 dias. Os resultados evidenciaram uma sensibilidade toxicológica para o MCF de 100% para os dois tipos de toxinas ao nível de 0,01 DL50, quando testados os sobrenadantes de meio de cultura, portanto 100 vezes superior ao Bioensaio em Camundongo. A sensibilidade toxicológica do MCF, quando examinados extratos hepáticos de camundongos inoculados com 1 e 10 DL50 de toxinas botulínicas C e D, foi inferior, com valores de 100, 80, 89 e 72%, respectivamente. Pelo teste foi possível detectar toxinas botulínicas tipos C e D nos extratos hepáticos de camundongos inoculados com doses subletais até 15 dias após a sua inoculação. A especificidade do MCF foi de 88 e 92%, quando testados extratos hepáticos de camundongos sadios, e confrontados com as antitoxinas C e D; e 100% no sobrenadante do meio de cultura. Os resultados apontam para uma possível utilização do teste como importante instrumento de pesquisa e ainda na eventual substituição dos testes in vivo pelas suas implicações éticas e limitações práticas.

Abstract in English:

An outbreak of acute diarrhoea in a mouse breeding colony was studied. In order to identify a causal pathogen of the diarrhoeic process a virological study was carried out. A homogenate of intestine originating from four diseased Young (21 days) animals was submitted to clarification and ultracentrifugation (100,000 g for 3 hours). The resulting sediment was processed for negative staining electron microscopy (EM) and inoculated into HEp-2 cell cultures. A cytopathic effect (CPE) resembling that of enteroviruses developed in these cultures. Homegenate of infected HEp-2 cells was clarified and inoculated in LLC-MK2 cell cultures and newborn swiss mice. Newborn mice developed spastic paralysis and LLC-MK2 cultures also presented enterovirus type CPE. Brain frozen sections of the inoculated animals were tested by Indirect Immunofluorescence (FA) and showed specific fluorescence for B4 coxsackievirus. The neutralization test (NT) in cell cultures, carried out with viral suspension originating from LLC-MK2 cultures, confirmed that coxsackie B4 was the isolated virus.

• Mouse diarrhoea coxsackievirus

Abstract in Portuguese:

Com o intuito de se identificar o eventual agente causador de diarréia aguda em uma colônia de criação de camundóngos brancos suíços, materiais de animais doentes foram estudados através de técnicas virológicas. O homogenato de intestinos originários de quatro animais (21 dias) doentes foi submetido à clarificação e ultracentrifugação (100.000 g por 3 horas). O sedimento resultante foi processado por coloração negativa e observado ao microscópio eletrônico (EM) e inoculado em culturas de células HEp-2. Estas culturas desenvolveram efeito citopático semelhante ao dos enterovírus. O homogenato de células HEp-2 infectadas foi clarificado e inoculado em células LLC-MK2 e em camundongos recém-natos por via intracerebral (branco suíço). Os animais desenvolveram paralisia espástica e as culturas de células LLC-MK2 também apresentaram efeito semelhante ao dos enterovírus. Seções de cérebro congelado de animais inoculados, foram testadas por imunofluorescência indireta (FA) e mostraram fluorescência específica para coxsackievírus grupo B4. O teste de neutralização (NT), em cultura de células, foi realizado com a suspensão originária de culturas de células LLC-MK2 infectadas e confirmou o isolamento do vírus Coxsackie B4.

• Camundongo diarréia coxsackievírus