PESQUISA VETERINÁRIA BRASILEIRA

Abstract in English:

ABSTRACT.- Preis I.S., Braga J.F.V., Couto R.M., Brasil B.S.A.F., Martins N.R.S. & Ecco R. 2013. Outbreak of infectious laryngotracheitis in large multi-age egg layer chicken flocks in Minas Gerais, Brazil. Pesquisa Veterinária Brasileira 33(5):591-596. Setor de Patologia Veterinária, Departamento de Clínica e Cirurgia Veterinária, Escola de Veterinária, Universidade Federal de Minas Gerais, Av. Antônio Carlos 6627, Belo Horizonte, MG 30123-970, Brazil. E-mail: ecco@vet.ufmg.br A recent (November 2010) outbreak of infectious laryngotracheitis (ILT) in a multi-age laying hen facility in Minas Gerais state, Brazil, is described. Previous ILT outbreak in laying hens was only notified in São Paulo state, Brazil, in 2002. In the outbreak described here, the affected population was approximately eight million hens, with flock sizes ranging from 100,000 to 2,900,000 chickens. The average mortality ranged from 1 to 6%, and morbidity was around 90% (most of the twenty seven farms of the area were positive for ILT virus). Three multi-age laying farms from one company were selected for this report. Clinical signs included prostration, dyspnea, conjunctivitis, occasional swelling of the paranasal sinuses and bloody mucous nasal discharge. Severely affected chickens presented with dyspnea, gasping and became cyanotic before death. At necropsy, these chickens had fibrinous exudate blocking the larynx and the lumen of cranial part of the trachea. In addition, conjunctivitis with intense hyperemia, edema and sinuses with caseous exudate were present. On histopathology, there were marked necrosis and desquamation of respiratory ephitelium and conjunctiva with numerous syncytial cells formation and fibrinous exudate. Moderate to marked non suppurative (especially lymphocytes and plasma cells) infiltration in the lamina propria also was observed. Sixteen out of 20 examined chickens, eosinophilic intranuclear inclusion bodies were observed in the syncytial cells. The DNA extracted from larynx and trachea produced positive PCR results for ILT virus (ILTV) DNA using formalin-fixed, paraffin embedded (FFPE) samples. Amplicons from a small region of ICP4 gene were submitted to sequencing and showed 100% identity with ILTV EU104910.1 (USA strain), 99% with ILTV JN596963.1 (Australian strain) and 91% with ILTV JN580316.1 (Gallid herpesvirus 1 CEO vaccine strain) and JN580315.1 (Gallid herpesvirus 1 TCO vaccine strain).

• Avian infectious laryngotracheitis Gallid herpesvirus 1 laringotraqueite infecciosa herpesvirus tipo 1 dos galináceos

Abstract in Portuguese:

RESUMO.- Preis I.S., Braga J.F.V., Couto R.M., Brasil B.S.A.F., Martins N.R.S. & Ecco R. 2013. Outbreak of infectious laryngotracheitis in large multi-age egg layer chicken flocks in Minas Gerais, Brazil. [Surto de laringotraqueíte infecciosa em granjas de galinhas poedeiras de múltiplas idades em Minas Gerais, Brasil.] Pesquisa Veterinária Brasileira 33(5):591-596. Setor de Patologia Veterinária, Departamento de Clínica e Cirurgia Veterinária, Escola de Veterinária, Universidade Federal de Minas Gerais, Av. Antônio Carlos 6627, Belo Horizonte, MG 30123-970, Brazil. E-mail: ecco@vet.ufmg.br Um surto recente (Novembro de 2010) de laringotraqueite infecciosa (LTI) em granjas de postura de múltiplas idades em Minas Gerais, Brasil, é descrito. Um surto de LTI em galinhas de postura havia sido previamente relatado apenas no Estado de São Paulo em 2002. No surto aqui descrito, a população afetada foi de aproximadamente oito milhões de galinhas, com lotes variando de 100.000 a 2.900.000 galinhas. A mortalidade média variou de 1 a 6% e a morbidade atingiu cerca de 90% (a maioria das 27 granjas foram positivas para o virus da LTI). Três granjas com aves de múltiplas idades pertencentes a uma empresa foram selecionadas para o presente relato. Os sinais clinicos incluíram prostração, dispneia, conjuntivite, edema ocasional dos seios paranasais e secreção nasal mucosa e/ou sanguinolenta. As aves severamente afetadas apresentaram acentuada dispneia, aparente engasgo e tornaram-se cianóticas antes da morte. Nestas aves, exsudato fibrinoso denso obstruindo o lúmen da laringe e parte cranial da traqueia foi observado na necropsia. Havia também, conjuntivite com hiperemia intensa e edema, além de sinusite com exsudato caseoso. Na histopatologia, observaram-se necrose e descamação acentuada do epitélio respiratório e da conjuntiva com formação de numerosos sincícios e exsudato fibrinoso. Além disso, infiltrado inflamatório mononuclear (especialmente linfócitos e plasmócitos) moderado a acentuado na lâmina própria foi observado. Corpúsculos de inclusão intranucleares nas células sinciciais foram observados em 16 das 20 aves examinadas. Resultados positivos pela PCR para o virus da LTI foram obtidos de DNA extraído das laringes e traqueias utilizando amostras fixadas em formol e incluidas na parafina. O produto amplificado de uma região pequena do gen ICP4 foi submetido ao sequenciamento e quando comparado com outras sequências depositadas no Genbank mostrou os seguintes resultados: 100% de identidade com uma estirpe do virus de LTI dos Estados Unidos (JN596963.1), 99% de identidade com uma estirpe Australiana e 91% com a estirpe vacinal CEO (JN580316.1) e TCO (JN580315.1).

Abstract in English:

ABSTRACT.- Cadore G.C., Weiss M., Anziliero D., Brum M.C.S., Weiblen R. & Flores E.F. 2013. A thymidine kinase-deleted bovine herpesvirus 5 establishes latent infection but reactivates poorly in a sheep model. Pesquisa Veterinária Brasileira 33(3):331-338. Departamento de Medicina Veterinária Preventiva, Universidade Federal de Santa Maria, Camobi, Santa Maria, RS 97105-900, Brazil. E-mail: eduardofurtadoflores@gmail.com The ability of thymidine kinase (tk)-deleted recombinant bovine herpesvirus 5 (BoHV-5tkD) to establish and reactivate latent infection was investigated in lambs. During acute infection, the recombinant virus replicated moderately in the nasal mucosa, yet to lower titers than the parental strain. At day 40 post-infection (pi), latent viral DNA was detected in trigeminal ganglia (TG) of all lambs in both groups. However, the amount of recombinant viral DNA in TGs was lower (9.7-fold less) than that of the parental virus as determined by quantitative real time PCR. Thus, tk deletion had no apparent effect on the frequency of latent infection but reduced colonization of TG. Upon dexamethasone (Dx) administration at day 40 pi, lambs inoculated with parental virus shed infectious virus in nasal secretions, contrasting with lack of infectivity in secretions of lambs inoculated with the recombinant virus. Nevertheless, some nasal swabs from the recombinant virus group were positive for viral DNA by PCR, indicating low levels of reactivation. Thus, BoHV-5 TK activity is not required for establishment of latency, but seems critical for efficient virus reactivation upon Dx treatment.

• BoHV-5

Abstract in Portuguese:

RESUMO.- Cadore G.C., Weiss M., Anziliero D., Brum M.C.S., Weiblen R. & Flores E.F. 2013. A thymidine kinase-deleted bovine herpesvirus 5 establishes latent infection but reactivates poorly in a sheep model. [Recombinante do herpesvírus bovino tipo 5 com deleção na timidina quinase estabelece infecção latente porém reativa ineficientemente em ovinos.] Pesquisa Veterinária Brasileira 33(3):331-338. Departamento de Medicina Veterinária Preventiva, Universidade Federal de Santa Maria, Camobi, Santa Maria, RS 97105-900, Brazil. E-mail: eduardofurtadoflores@gmail.com A capacidade de um recombinante do herpesvírus bovino tipo 5 com deleção no gene da timidina quinase (BoHV-5tk∆) em estabelecer e reativar infecção latente foi investigada em cordeiros. Durante a infecção aguda, o vírus recombinante replicou na mucosa nasal em títulos moderados, porém menores do que os da cepa parental. Aos 40 dias pós-infecção (pi) DNA viral latente foi detectado no gânglio trigêmeo (TG) de todos os cordeiros em ambos os grupos. No entanto, a quantidade de DNA do vírus recombinante nos TGs foi 9,7 vezes menor do que do vírus parental, segundo determinação por PCR em tempo real. Assim, a deleção do gene tk (timidina quinase) não produziu efeito aparente sobre a frequência da infecção latente, porém reduziu a colonização do TG. Após a administração de dexametasona (Dx) no dia 40pi, os cordeiros inoculados com o vírus parental excretaram partículas virais infecciosas, contrastando com a falta de infectividade nas secreções nasais dos animais inoculados com o vírus recombinante. Entretanto, alguns suabes nasais dos cordeiros do grupo do vírus recombinante foram positivos para o DNA viral por PCR, indicando baixos níveis de reativação. Assim, a atividade da enzima timidina quinase não é requerida para o estabelecimento de latência pelo BoHV-5, mas parece fundamental para reativação eficiente da infecção latente após tratamento com Dx.

Abstract in English:

ABSTRACT.- Oliveira S.A.M., Brum M.C.S., Anziliero D., Dellagostin O., Weiblen R. & Flores E.F. 2013. Prokaryotic expression of a truncated form of bovine herpesvirus 1 glycoprotein E (gE) and use in an ELISA for gE antibodies. Pesquisa Veterinária Brasileira 33(1):41-46. Setor de Virologia, Departamento de Medicina Veterinária Preventiva, Universidade Federal de Santa Maria, Avenida Roraima 1000, Santa Maria, RS 97105-900, Brazil. E-mail: eduardofurtadoflores@gmail.com This article describes the expression of a truncated form of bovine herpesvirus 1 (BoHV-1) glycoprotein E (gE) for use as immunodiagnostic reagent. A 651 nucleotide fragment corresponding to the amino-terminal third (217 amino acids) of BoHV-1 gE - that shares a high identity with the homologous BoHV-5 counterpart - was cloned as a 6×His-tag fusion protein in an Escherichia coli expression vector. A soluble protein of approximately 25 kDa purified from lysates of transformed E. coli was recognized in Western blot (WB) by anti-6xHis-tag and anti-BoHV-1 gE monoclonal antibodies. In addition, the recombinant protein was specifically recognized in WB by antibodies present in the sera of cattle seropositive to BoHV-1 and BoHV-5. An indirect ELISA using the expressed protein as coating antigen performed comparably to a commercial anti-gE ELISA and was able to differentiate serologically calves vaccinated with a gE-deleted BoHV-5 strain from calves infected with BoHV-1. Thus, the truncated gE may be useful for serological tests designed to differentiate BoHV-1/BoHV-5 infected animals from those vaccinated with gE-negative marker vaccines.

• BoHV-5 bovine herpesvirus vaccine herpesvírus bovino vacina diferencial

Abstract in Portuguese:

RESUMO.- Oliveira S.A.M., Brum M.C.S., Anziliero D., Dellagostin O., Weiblen R. & Flores E.F. 2013. Prokaryotic expression of a truncated form of bovine herpesvirus 1 glycoprotein E (gE) and use in an ELISA for gE antibodies. [Expressão procariota de uma forma truncada da glicoproteína E (gE) do herpesvírus bovino tipo 1 e uso em ELISA para anticorpos contra a gE.] Pesquisa Veterinária Brasileira 33(1):41-46. Setor de Virologia, Departamento de Medicina Veterinária Preventiva, Universidade Federal de Santa Maria, Avenida Roraima 1000, Santa Maria, RS 97105-900, Brazil. E-mail: eduardofurtadoflores@gmail.com Este trabalho relata a expressão de uma forma truncada da glicoproteína E (gE) do herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1) para uso em imunodiagnóstico. Um fragmento de 651 pares de bases (pb) correspondente ao terço amino-terminal (217 aminoácidos) da gE do BoHV-1 – que compartilha uma alta identidade com a gE do BoHV-5 – foi clonada como proteína de fusão com cauda 6x de histidina em um vetor de expressão em Escherichia coli. Uma proteína solúvel de aproximadamente 25 kDa purificada de lisados de E.coli foi reconhecida em Western blot (WB) por anticorpos monoclonais anti-6xHis-tag e anti-gE. Além disso, a proteína recombinante purificada foi reconhecida em WB por anticorpos presentes no soro de animais soropositivos ao BoHV-1 e BoHV-5. Um ELISA indireto utilizando a proteína recombinante como antígeno apresentou performance comparável a um ELISA gE comercial e foi capaz e diferenciar sorologicamente animais vacinados com uma cepa gE-negativa de BoHV-5 de animais infectados com o BoHV-1. Portanto, a gE truncada pode ser útil em testes sorológicos diferenciais para uso conjunto com vacinas com marcador antigênico gE para o BoHV-1 e BoHV-5.

Abstract in English:

ABSTRACT.- Preliasco M., Easton M.C., Paullier C., Rivero R., Moraes D.F.S.D., Godoy I., Dutra V. & Nakazato L. 2013. [Diagnosis of malignant catarrhal fever in cattle in Uruguay.] Diagnóstico de Febre Catarral Maligna em bovinos do Uruguai. Pesquisa Veterinária Brasileira 33(1):52-56. Laboratorio Central “Miguel C. Rubino”, División de Laboratorios Veterinarios del Ministerio de Ganadería Agricultura y Pesca de Uruguay, Ruta 8 km, C.P. 12.100, Montevideo, 17.500, Uruguay. E-mail: mpreliasco@mgap.gub.uy A retrospective study of 14 outbreaks of malignant catarrh fever (MCF) in cattle detected between 1999 and 2011 was performed based upon the files of the DILAVE “Miguel C. Rubino” Montevideo Pathology Laboratory. Epidemiological data, clinical presentation, gross and histopathological lesions were analyzed. PCR was used on central nervous system samples of 12 bovines for the detection of ovine herpesvirus type 2 (OvHV-2). The outbreaks occurred mainly in spring and summer in the northern region of the country. Sixty four percent (9/14) were individual episodes of the disease while five cases were collective, with morbidity and mortality rates were 2-5%, being the lethality 100% in all the reports. In 50% of the outbreaks the direct contact between cattle and sheep was confirmed, while there was not such information in the rest of the cases. Predominant clinical signs were bilateral corneal opacity, conjunctivitis, ocular and nasal mucopurulent discharge, and nervous syndrome. The most frequent necropsy findings were bilateral corneal opacity and inflammatory lesions in the mucosa. Histopathological findings were characterized by systemic necrotizing panvasculite. It was possible to detect the etiological agent by PCR in 5 out of 12 cases examined.

• Malignant catarrhal fever ovine herpesvirus type 2 Febre catarral maligna herpesvírus ovino tipo 2

Abstract in Portuguese:

RESUMO.- Preliasco M., Easton M.C., Paullier C., Rivero R., Moraes D.F.S.D., Godoy I., Dutra V. & Nakazato L. 2013. [Diagnosis of malignant catarrhal fever in cattle in Uruguay.] Diagnóstico de Febre Catarral Maligna em bovinos do Uruguai. Pesquisa Veterinária Brasileira 33(1):52-56. Laboratorio Central “Miguel C. Rubino”, División de Laboratorios Veterinarios del Ministerio de Ganadería Agricultura y Pesca de Uruguay, Ruta 8 km, C.P. 12.100, Montevideo, 17.500, Uruguay. E-mail: mpreliasco@mgap.gub.uy Foi realizado um estudo retrospectivo de 14 focos de febre catarral maligna (FCM) em bovinos, detectados nos anos de 1999-2011, a partir dos arquivos da Seção Anatomia Patológica da Divisão de Laboratórios Veterinários (DILAVE) “Miguel C. Rubino” Montevideo. Foram analisados os dados epidemiológicos, apresentação clínica e lesões macroscópicas e histopatológicas. Para a detecção do herpesvírus ovino tipo 2 (OvHV-2) foi utilizada a técnica de PCR sobre as amostras do sistema nervoso central de bovinos de 12 focos. Os surtos ocorreram principalmente nos meses de primavera e verão, na região norte do país. Em 64% (9/14) dos focos ocorreram episódios individuais da enfermidade, enquanto que os casos coletivos foram 5, nos quais a morbidade e mortalidade oscilaram entre 2% e 5%, sendo a letalidade 100% em todos os relatos. Em 50% dos surtos foi confirmado o contato direto entre bovinos e ovinos, enquanto no restante não havia tal informação. Clinicamente predominaram os sinais de opacidade bilateral da córnea, conjuntivite, secreção nasal e ocular mucopurulenta, assim como a síndrome nervosa. Os achados de necropsia mais frequentes foram opacidade bilateral da córnea e lesões inflamatórias nas mucosas. Os achados histopatológicos caracterizaram-se por panvasculite necrótica sistêmica. Foi possível detectar o agente etiológico por PCR em 5 dos 12 casos analisados.

Abstract in English:

ABSTRACT.- Headley S.A., Sousa I.K.F., Minervino A.H.H., Barros I.O., Barrêto Júnior R.A., Alfieri A.F., Ortolani E.L. & Alfieri A.A. 2012. Molecular confirmation of ovine herpesvirus 2-induced malignant catarrhal fever lesions in cattle from Rio Grande do Norte, Brazil. Pesquisa Veterinária Brasileira 32(12):1213-1218. Laboratório de Patologia Veterinária, Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Norte do Paraná, PR 218 Km 1, Cx. Postal 560, Arapongas, PR 86702-670, Brazil. E-mail: headleysa@gmail.com Molecular findings that confirmed the participation of ovine herpesvirus 2 (OHV-2) in the lesions that were consistent with those observed in malignant catarrhal fever of cattle are described. Three mixed-breed cattle from Rio Grande do Norte state demonstrated clinical manifestations that included mucopurulent nasal discharge, corneal opacity and motor incoordination. Routine necropsy examination demonstrated ulcerations and hemorrhage of the oral cavity, corneal opacity, and lymph node enlargement. Significant histopathological findings included widespread necrotizing vasculitis, non-suppurative meningoencephalitis, lymphocytic interstitial nephritis and hepatitis, and thrombosis. PCR assay performed on DNA extracted from kidney and mesenteric lymph node of one animal amplified a product of 423 base pairs corresponding to a target sequence within the ovine herpesvirus 2 (OHV-2) tegument protein gene. Direct sequencing of the PCR products, from extracted DNA of the kidney and mesenteric lymph node of one cow, amplified the partial nucleotide sequences (423 base pairs) of OHV-2 tegument protein gene. Blast analysis confirmed that these sequences have 98-100% identity with similar OHV-2 sequences deposited in GenBank. Phylogenetic analyses, based on the deduced amino acid sequences, demonstrated that the strain of OHV-2 circulating in ruminants from the Brazilian states of Rio Grande do Norte and Minas Gerais are similar to that identified in other geographical locations. These findings confirmed the active participation of OHV-2 in the classical manifestations of sheep associated malignant catarrhal fever.

• Ovine herpesvirus 2 malignant catarrhal fever gammaherpesvirus herpesvírus ovino tipo 2 febre catarral malígna

Abstract in Portuguese:

RESUMO.- Headley S.A., Sousa I.K.F., Minervino A.H.H., Barros I.O., Barrêto Júnior R.A., Alfieri A.F., Ortolani E.L. & Alfieri A.A. 2012. Molecular confirmation of ovine herpesvirus 2-induced malignant catarrhal fever lesions in cattle from Rio Grande do Norte, Brazil. [Diagnóstico molecular de herpesvírus ovino tipo 2 em surto de febre catarral malígna em bovinos do Rio Grande do Norte.] Pesquisa Veterinária Brasileira 32(12):1213-1218. Laboratório de Patologia Veterinária, Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Norte do Paraná, PR 218 Km 1, Cx. Postal 560, Arapongas, PR 86702-670, Brazil. E-mail: headleysa@gmail.com Os achados moleculares confirmaram a participação do herpesvírus ovino tipo 2 (OHV-2) nas lesões observadas em um surto de febre catarral malígna em bovinos. Três bovinos oriundos de propriedade rural de Mossoró, Rio Grande do Norte apresentaram manifestações clínicas, que incluíram secreção nasal mucopurulenta, opacidade da córnea e incoordenação motora. A necropsia revelou ulcerações e hemorragias da cavidade oral, opacidade da córnea e linfonodomegalia. Os achados histopatológicos significativos incluíam vasculite necrosante generalizada, meningoencefalite não supurativa, nefrite intersticial linfocítica, hepatite linfocítica e trombose. A PCR, realizada a partir de DNA extraído do rim e do linfonodo mesentérico de um dos animais, amplificou um produto com 423 pares de base do gene da proteína do tegumento do herpesvírus ovino 2 (OHV-2). O sequenciamento direto dos produtos da PCR e a análise pelo Blast demonstraram que o produto amplificado apresentava 98-100% de identidade com sequências do OHV-2 depositadas no GenBank. As análises filogenéticas, baseadas nas sequências deduzidas de aminoácidos demonstraram que a cepa de OHV-2 circulando em ruminantes nos estados de Rio Grande do Norte e Minas Gerais são semelhantes àquelas identificadas em outras regiões geográficas. Esses achados confirmam a participação ativa de OHV-2 nas manifestações clássicas de febre catarral maligna em ovinos.

Abstract in English:

Fibropapillomatosis (FP) is a benign tumoral disease that affects sea turtles, hampering movement, sight and feeding, ultimately leading to death. In Brazil, the disease was described for the first time in 1986. Research suggests the involvement of a herpesvirus in association with environmental and genetic factors as causal agents of FP. The objective of the present study was to detect and characterize this herpesvirus in sea turtles living in the coast of state Rio Grande do Sul (RS), Brazil. From October 2008 to July 2010, 14 turtles were observed between the beaches of Torres and Tavares, of which 11 were green turtles (Chelonia mydas) and 3 were loggerhead turtles (Caretta caretta). All turtles were young and mean curved carapace length was 37.71±7.82cm, and varied from 31 to 55cm. Only one green turtle presented a 1cm, papillary, pigmented fibropapilloma. Skin and fibropapilloma samples were analyzed by conventional and real time PCR assays to detect and quantify herpesvirus. All skin samples were negative, though the fibropapilloma specimen was positive in both tests. Viral load was 9,917.04 copies of viral genome per milligram of tissue. The DNA fragment amplified from the fibropapilloma sample was sequenced and allocated in the Atlantic phylogeographic group. This study reports the first molecular characterization of herpesvirus associated with fibropapilloma in turtles from the coast of RS.

• Fibropapilloma sea turtle herpesvirus Brazil

Abstract in Portuguese:

A fibropapilomatose (FP) é uma doença tumoral benigna que pode causar a morte das tartarugas marinhas por dificultar a sua locomoção, visão e alimentação. Pesquisas sugerem o envolvimento de um herpesvirus em associação com fatores ambientais e genéticos como agentes causais da FP. No Brasil, foi descrita pela primeira vez em 1986. O objetivo do presente trabalho foi detectar e caracterizar esse herpesvírus em tartarugas marinhas do litoral do Estado do Rio Grande do Sul (RS). De outubro de 2008 a julho de 2010, foram encontradas 14 tartarugas marinhas entre as praias de Torres e Tavares, das quais 11 eram tartarugas verdes (Chelonia mydas) e 3 eram tartarugas cabeçudas (Caretta caretta). Todas as tartarugas eram jovens e o comprimento curvilíneo de carapaça médio foi de 37,71±7,82cm, variando de 31 a 55cm. Apenas uma tartaruga verde apresentou um fibropapiloma de 1cm, pigmentado e de superfície papilar. Amostras de pele e do fibropapiloma foram submetidas a PCR convencional e PCR em tempo real para detecção e quantificação do herpesvírus. Todas as amostras de pele foram negativas e o fibropapiloma foi positivo em ambas as técnicas, apresentando uma carga viral de 9.917,04 cópias de genoma viral/mg de tecido. O fragmento de DNA amplificado na amostra de fibropapiloma foi sequenciado e revelou pertencer ao grupo filogeográfico do Atlântico. Essa é a primeira caracterização molecular do herpesvirus associado ao fibropapiloma em tartarugas do litoral do RS.

• Fibropapiloma tartaruga marinha herpesvírus Brasil

Abstract in English:

ABSTRACT.- Cadore G.C., Anziliero D., Weiblen R. & Flores E.F. 2011. [Reactivation and distribution of bovine herpesvirus 5 DNA in the brain of latently infected sheep.] Reativação e distribuição do DNA do herpesvírus bovino tipo 5 no encéfalo de ovinos latentemente infectados. Pesquisa Veterinária Brasileira 31(12):1090-1096. Departamento de Medicina Veterinária Preventiva, Universidade Federal de Santa Maria, Camobi, Santa Maria, RS 97105-900, Brazil. E-mail: eduardofurtadoflores@gmail.com The biology of latent infection by bovine herpesvirus type 5 (BoHV-5) has been studied in cattle and rabbits, yet many aspects remain poorly understood. We herein investigated the suitability of lambs to investigate aspects of BoHV-5 latency. Thirteen six-month-old lambs inoculated intranasally (IN) with BoHV-5 strain SV-507/99 (titer of 106.8 TCID50/mL) shed the virus in nasal secretions in titers up 105.5 TCID50/mL, during up to 11 days, developing virus neutralizing (VN) titers of 16 to 128 at day 30 post-inoculation (pi). The inoculated animals developed only a mild serous nasal secretion and transient hyperthermia. Examination of brain sections of five lambs euthanized at day 30 pi by PCR revealed the presence of latent DNA in the trigeminal ganglia (TG, 5 out of five), olfactory bulbs (OB, 5/5), pons (2/5), cerebellum (2/5) and cerebral cortex (1/5). Administration of dexamethasone (Dx, n=4) or flumethasone (FluM, n=4) to eight latently infected lambs at day 65 pi resulted in virus reactivation and shedding by 3 out of 4 individuals in each group. Virus shedding in nasal secretions started at day 3 post-treatment and lasted up to five days (1-5) in Dx treated lambs (titers up to 102.8TCID50/mL), was delayed and lasted up to three days (1-3) in FluM-treated lambs (titers up to 102.1 TCID50/mL). PCR examination of the brains of animals submitted to reactivation, at day 30 post-treatment, showed a pattern of distribution of latent viral DNA fairly similar to that found in those not submitted to reactivation. In summary, the ability of BoHV-5 to establish latent infection, the consistent colonization of TGs and OBs by latent viral DNA and virus reactivation induced by corticosteroid treatment are promising findings towards the use of lambs to study selected aspects of BoHV-5 latency.

• BoHV-5 Bovine herpesvirus 5 herpesvírus bovino tipo 5

Abstract in Portuguese:

RESUMO.- Cadore G.C., Anziliero D., Weiblen R. & Flores E.F. 2011. [Reactivation and distribution of bovine herpesvirus 5 DNA in the brain of latently infected sheep.] Reativação e distribuição do DNA do herpesvírus bovino tipo 5 no encéfalo de ovinos latentemente infectados. Pesquisa Veterinária Brasileira 31(12):1090-1096. Departamento de Medicina Veterinária Preventiva, Universidade Federal de Santa Maria, Camobi, Santa Maria, RS 97105-900, Brazil. E-mail: eduardofurtadoflores@gmail.com A biologia da infecção latente pelo herpesvírus bovino tipo 5 (BoHV-5) tem sido estudada em bovinos e coelhos, mas vários aspectos permanecem desconhecidos. Este artigo relata uma avaliação de ovinos jovens como modelo para o estudo da infecção latente pelo BoHV-5. Treze cordeiros com idade entre seis e sete meses, inoculados pela via intranasal (IN) com a cepa SV-507/99 do BoHV-5 (título de 106,8 DICC50/mL) excretaram o vírus em secreções nasais em títulos de até 105,5 DICC50/mL, com duração de até 11 dias, desenvolvendo anticorpos neutralizantes em títulos de 16 a 128 no dia 30 pós-inoculação (pi). Os ovinos inoculados apresentaram apenas secreção nasal serosa leve e hipertermia transitória. O PCR de secções do encéfalo de cinco animais inoculados no dia 30 pi revelou a presença de DNA viral latente nos gânglios trigêmeos (TG, 5 de 5 animais), bulbo olfatório (BO, 5/5), ponte (2/5), cerebelo (2/5), córtex cerebral (1/5). Administração de dexametasona (Dx, n=4) ou flumetasona (FluM, n=4) a oito ovinos no dia 65 pi resultou em reativação e excreção viral por 3 de 4 animais de cada grupo. A excreção viral nas secreções nasais iniciou no dia 3 pós-tratamento e durou entre 1 e 5 dias nos ovinos tratados com Dx (títulos até 102,8TCID50/mL) e foi mais tardia, durando entre 1 e 3 dias nos animais tratados com FluM (títulos de 102,1 TCID50/mL). Uma análise por PCR do encéfalo dos animais submetidos à reativação, no dia 65 pós-infecção, revelou uma distribuição do DNA latente semelhante àquela observada nos animais não submetidos à reativação. Em resumo, a capacidade do BoHV-5 estabelecer infecção latente, a colonização dos TGs a BOs com DNA viral latente e a reativação induzida por corticoides são achados promissores para o uso de cordeiros como modelo para a infecção latente pelo BoHV-5.

Abstract in English:

ABSTRACT.- Silva S.C., Brum M.C.S., Oliveira S.A.M., Weiblen R. & Flores E.F. 2011. A thymidine kinase-negative bovine herpesvirus 5 is highly attenuated for rabbits, but is neuroinvasive and establishes latent infection. Pesquisa Veterinária Brasileira 31(5):389-397. Departamento de Medicina Veterinária Preventiva, Universidade Federal de Santa Maria, Camobi, Santa Maria, RS 97105-900, Brazil. E-mail: eduardofurtadoflores@gmail.com Mutant viral strains deleted in non-essential genes represent useful tools to study the function of specific gene products in the biology of the virus. We herein describe an investigation on the phenotype of a bovine herpesvirus 5 (BoHV-5) recombinant deleted in the gene encoding the enzyme thymidine kinase (TK) in rabbits, with special emphasis to neuroinvasiveness and the ability to establish and reactivate latent infection. Rabbits inoculated with the parental virus (SV-507/99) (n=18) at a low titer (105.5TCID50) shed virus in nasal secretions in titers up to 104.5TCID50 for up to 12 days (average: 9.8 days [5-12]) and 5/16 developed neurological disease and were euthanized in extremis. Rabbits inoculated with the recombinant BoHV-5TKD at a high dose (107.1TCID50) also shed virus in nasal secretions, yet to lower titers (maximum: 102.3TCID50) and for a shorter period (average: 6.6 days [2-11]) and remained healthy. PCR examination of brain sections of inoculated rabbits at day 6 post-infection (pi) revealed a widespread distribution of the parental virus, whereas DNA of the recombinant BoHV-5TKD-was detected only in the trigeminal ganglia [TG] and olfactory bulbs [OB]. Nevertheless, during latent infection (52pi), DNA of the recombinant virus was detected in the TGs, OBs and also in other areas of the brain, demonstrating the ability of the virus to invade the brain. Dexamethasone (Dx) administration at day 65 pi was followed by virus reactivation and shedding by 5/8 rabbits inoculated with the parental strain (mean duration of 4.2 days [1 – 9]) and by none of seven rabbits inoculated with the recombinant virus. Again, PCR examination at day 30 post-Dx treatment revealed the presence of latent DNA in the TGs, OBs and in other areas of the brain of both groups. Taken together, these results confirm that the recombinant BoHV-5TKD is highly attenuated for rabbits. It shows a reduced ability to replicate in the nose but retains the ability to invade the brain and to establish latent infection. Additional studies are underway to determine the biological and molecular mechanisms underlying the inability of BoHV-5TKD to reactivate from latency.

• BoHV-5 neuroinvasiveness thymidine kinase-bovine herpesvirus 5 neuroinvasividade herpesvírus bovino tipo 5 timidina quinase

Abstract in Portuguese:

RESUMO.- Silva S.C., Brum M.C.S., Oliveira S.A.M., Weiblen R. & Flores E.F. 2011. A thymidine kinase-negative bovine herpesvirus 5 is highly attenuated for rabbits, but is neuroinvasive and establishes latent infection. [Cepa do herpesvírus bovino tipo 5 defectiva na timidina quinase é altamente atenuada para coelhos mas é neuroinvasiva e estabelece infecção latente.] Pesquisa Veterinária Brasileira 31(5):389-397. Departamento de Medicina Veterinária Preventiva, Universidade Federal de Santa Maria, Camobi, Santa Maria, RS 97105-900, Brazil. E-mail: eduardofurtadoflores@gmail.com Cepas virais mutantes defectivas em genes não essenciais se constituem em ferramentas úteis para o estudo da função de proteínas virais na biologia dos vírus. Este estudo relata uma investigação do fenótipo, em coelhos, de uma cepa recombinante do herpesvírus bovino tipo 5 (BoHV-5) defectiva na enzima timidina quinase (TK), com ênfase para a neuroinvasividade e capacidade de estabelecer e reativar a infecção latente. Coelhos inoculados com o vírus parental (SV-507/99, n=18) em baixo título (105,5TCID50) excretaram o vírus nas secreções nasais em títulos de até 104,5TCID50/mL por até 12 dias (média: 9,8 dias [5-12]) e 5/16 desenvolveram doença neurológica e morreram ou foram eutanasiados in extremis. Em contraste, coelhos inoculados com o recombinante BoHV-5TKD em alto título (107,1TCID50) excretaram o vírus em títulos inferiores (máximo 102,3TCID50/mL), por um período menor (média: 6,6 days [2-11]) e permaneceram saudáveis. A realização de PCR em seções do encéfalo no dia 6 pós-infecção (pi) revelou uma ampla distribuição do DNA do vírus parental, enquanto o DNA do vírus recombinante foi detectado apenas nos gânglios trigêmeos [TGs] e nos bulbos olfatórios [OBs]. Não obstante, durante a infecção latente (52pi), o DNA do vírus recombinante foi detectado nos TGs, OBs e em outros locais do encéfalo, demonstrando que o vírus recombinante mantém a neuroinvasividade. Tratamento com dexamethasona (Dx) no dia 65 pi resultou em reativação e excreção viral por 5/8 dos coelhos inoculados com o vírus parental (duração média de 4,2 dias [1-9]) e por nenhum dos sete coelhos inoculados com o vírus recombinante. No entanto, PCR realizado no dia 30 pós-Dx revelou a presença de DNA latente do BoHV-5TKD nos TGs, OBs e em outras áreas do encéfalo. Esses resultados confirmam que o recombinante BoHV-5TKD é altamente atenuado para coelhos. A sua capacidade de replicação na mucosa nasal é reduzida, mas mantém a capacidade de invadir o encéfalo e estabelecer infecção latente. Estudos adicionais estão em andamento para elucidar os mecanismos responsáveis pela incapacidade do recombinante de reativar a infecção latente.

Abstract in English:

ABSTRACT.- Santos C.M.B., Anziliero D., Bauermann F.V., Brum M.C.S., Weiblen R. & Flores E.F. 2011. Experimental infection of calves with recombinants of bovine herpesvirus 5 defective in glycoprotein E (gE), thymidine kinase (TK) and both, gE/TK. Pesquisa Veterinária Brasileira 31(4):319-325. Departamento de Medicina Veterinária Preventiva, Universidade Federal de Santa Maria, Camobi, Santa Maria, RS 97105-900, Brazil. E-mail: eduardofurtadoflores@gmail.com This article describes an investigation on the virulence/attenuation of bovine herpesvirus type 5 (BoHV-5) recombinants deleted in the genes encoding glycoprotein E (BoHV-5gED), thymidine kinase (BoHV-5TKD), and both gE and TK (BoHV-5gEDTKD). Seronegative calves (80 to 90 days-old) inoculated with the parental strain (SV-507/99, n=5) shed virus in nasal secretions for up to 15 days (average 10.8 days). Duration of virus shedding was 11 days for BoHV-5gD, 9.6 days for BoHV-5TKD and 6.2 days for BoHV-5gEDTKD groups. The highest titers were observed between days 1 and 6 post-infection (pi) for SV-507/99 (106.8TCID50/mL), 105.1TCID50/mL (BoHV-5gED), 105.9TCID50/mL (BoHV-5TKD) and 104.7TCID50/mL (BoHV-5gEDTKD). Calves inoculated with the parental virus presented anorexia, profound apathy and loss of body condition. Two calves were euthanized in extremis on days 10 and 11 pi; infectious virus was recovered from several areas of the brain. In contrast, calves inoculated with the recombinants remained healthy and a few presented a mild and transient nasal secretion. Dexamethasone (Dx) administration at day 42 pi resulted in virus shedding by all controls calves (mean duration 3.7 days), by 2/5 of BoHV-5TKD calves (two days) and 2/5 of BoHV-5gED (one day). No virus shedding was detected in BoHV-5gEDTKD calves upon Dx treatment. PCR examination of brain sections of calves euthanized at day 30 post Dx treatment revealed the presence of latent viral DNA widely distributed in the brain of SV-507/99 calves. Latent viral DNA was detected in a few sections (3/30) of the brains of BoHV-5gED calves and was not detected in the brains of calves inoculated with BoHV-5TKD and BoHV-5gEDTKD. These results show that the single BoHV-5 mutants (gE and tk-deleted) are attenuated for calves and establish and/or reactivate latent infection inefficiently. The double mutant BoHV-5gEDTKD is fully attenuated and appears not to establish or not reactivate efficiently from latent infection. Thus, these recombinants, especially the double mutant BoHV-5gEDTKD, display an adequate phenotype for use in modified-live vaccine formulations.

• Bovine herpesvirus 5 glycoprotein E thymidine kinase BoHV-5 herpesvírus bovino tipo 5 glicoproteína E timidina quinase

Abstract in Portuguese:

RESUMO.- Santos C.M.B., Anziliero D., Bauermann F.V., Brum M.C.S., Weiblen R. & Flores E.F. 2011. Experimental infection of calves with recombinants of bovine herpesvirus 5 defective in glycoprotein E (gE), thymidine kinase (TK) and both, gE/TK. [Infecção experimental de bezerros com recombinantes do herpesvírus bovino tipo 5 defectivos na glicoproteína E (gE), timidina quinase (TK) e ambos, gE/TK.] Pesquisa Veterinária Brasileira 31(4):319-325. Departamento de Medicina Veterinária Preventiva, Universidade Federal de Santa Maria, Camobi, Santa Maria, RS 97105-900, Brazil. E-mail: eduardofurtadoflores@gmail.com Este artigo descreve uma investigação da virulência/atenuação de recombinantes do herpesvírus bovino tipo 5 (BoHV-5) com deleções nos genes da glicoproteína E (BoHV-5gED), timidina quinase (BoHV-5TKD), e ambos gE e TK (BoHV-5gEDTKD). Bezerros soronegativos (80-90 dias de idade) inoculados com o vírus parental SV-507/99 (n=5) excretaram o vírus em secreções nasais por até 15 dias (média de 10,8 dias). Nos animais inoculados com os recombinantes, a duração da excreção viral foi de 11 dias (BoHV-5gED), 9,6 dias (BoHV-5TKD) e 6,2 dias (BoHV-5gEDTKD). Os maiores títulos foram observados entre os dias 1 e 6 pós-inoculação (pi), sendo de 106,8TCID50/mL para o SV-507/99, 105,1TCID50/mL (BoHV-5gED), 105,9TCID50/mL (BoHV-5TKD) e 104,7TCID50/mL (BoHV-5gEDTKD). Os bezerros inoculados com o vírus parental apresentaram anorexia e apatia; três deles mostraram apatia profunda e perda da condição corporal. Dois bezerros foram eutanasiados in extremis nos dias 10 e 11 pi, respectivamente e o vírus foi isolado de várias regiões do encéfalo. Já os bezerros inoculados com os recombinantes permaneceram saudáveis; alguns apresentaram uma secreção nasal serosa transitória. Administração de dexametasona (Dx) no dia 42 pi resultou em excreção viral por todos os bezerros inoculados com o vírus parental (duração média de 3,7 dias), por 2 de 5 bezerros dos grupos BoHV-5TKD (dois dias) e BoHV-5gED (um dia). Os bezerros inoculados com o duplo mutante BoHV-5gEDTKD não excretaram o vírus após o tratamento com Dx. Pesquisa de DNA viral por PCR no dia 30 pós-Dx revelou uma ampla distribuição do DNA do vírus parental no encéfalo; poucas seções (3/30) foram positivas no encéfalo dos animais do grupo BoHV-5gED, e não detectou-se DNA latente no encéfalo dos animais dos grupos BoHV-5TKD e BoHV-5gEDTKD. Esses resultados demonstram que os mutantes simples (gE and tk-deletados) são atenuados para bezerros e estabelecem e/ou reativam infecção latente ineficientemente. Já o duplo mutante BoHV-5gEDTKD é atenuado e parece não estabelecer e/ou não reativar eficientemente a infecção latente. Portanto, os vírus recombinantes, e em especial o duplo mutante BoHV-5gEDTKD apresentam um fenótipo compatível com a sua inclusão em vacinas vivas modificadas.

Abstract in English:

ABSTRACT.- Anziliero D., Santos C.M.B., Bauermann F.V., Cardozo L., Bernardes L.M., Brum M.C.S., Weiblen R. & Flores E.F. 2011. [A recombinant bovine herpesvirus 5 defective in thymidine kinase and glycoprotein E is attenuated and immunogenic for calves.] Cepa recombinante do herpesvírus bovino tipo 5 defectiva na timidina quinase e glicoproteína E é atenuada e imunogênica para bezerros. Pesquisa Veterinária Brasileira 31(1):23-30. Departamento de Medicina Veterinária Preventiva, Universidade Federal de Santa Maria, Camobi, Santa Maria, RS 97105-900, Brazil. E-mail: eduardofurtadoflores@gmail.com Bovine herpesvirus 5 (BoHV-5) is an important pathogen of cattle in South America and efforts have been made to produce safer and more effective vaccines. In addition to afford protection, herpesvirus vaccines should allow serological differentiation of vaccinated from naturally, latently infected animals. We previously reported the construction and characterization in vitro of a double mutant BoHV-5 (BoHV-5gE/TK”D) lacking the genes encoding thymidine kinase (tk) for attenuation, and glycoprotein E (gE) as the antigenic marker, as a vaccine candidate strain (Brum et al. 2010a). The present article reports an investigation on the attenuation and immunogenicity of this recombinant in calves. In a first experiment, 80 to 90-day-old seronegative calves (n=6) inoculated intranasally with the recombinant (titer of 107.5TCID50) shed virus in low to moderate titers in nasal secretions for up to 6 days, yet did not develop any respiratory, systemic or neurological signs of infection. At day 30 post-infection (pi) all calves had BoHV-5 specific neutralizing (VN) antibodies in titers of 4 to 8 and were negative for anti-gE antibodies in a commercial ELISA test. Administration of dexamethasone (0.1mg/kg/day during 5 days) to four of these calves at day 42 pi did not result in virus shedding or increase in VN titers, indicating lack of viral reactivation. Secondly, a group of 8-month-old calves (n=9) vaccinated intramuscularly (IM) with the recombinant virus (107.5TCID50/animal) did not shed virus in nasal secretions, remained healthy and developed VN titers from 2 to 8 at day 42 post-vaccination (pv), remaining negative for gE antibodies. Lastly, 21 calves (around 10 months old) maintained under field conditions were vaccinated IM with the recombinant virus (titer of 107.3TCID50). All vaccinated animals developed VN titers from 2 to 16 at day 30 pv. A boost vaccination performed at day 240 pv resulted in a rapid and strong anamnestic antibody response, with VN titers reaching from 16 to 256 at day 14 post-booster. Again, serum samples remained negative for gE antibodies. Selected serum samples from vaccinated animals showed a broad VN activity against nine BoHV-5 and eight BoHV-1 field isolates. These results show that the recombinant virus is attenuated, immunogenic for calves and induces an antibody response differentiable from that induced by natural infection. Thus, the recombinant BoHV-5gE/TKD is an adequate candidate strain for a modified live vaccine.

• Bovine herpesvirus 5 vaccine herpesvírus bovino 5 vacina

Abstract in Portuguese:

RESUMO.- Anziliero D., Santos C.M.B., Bauermann F.V., Cardozo L., Bernardes L.M., Brum M.C.S., Weiblen R. & Flores E.F. 2011. [A recombinant bovine herpesvirus 5 defective in thymidine kinase and glycoprotein E is attenuated and immunogenic for calves.] Cepa recombinante do herpesvírus bovino tipo 5 defectiva na timidina quinase e glicoproteína E é atenuada e imunogênica para bezerros. Pesquisa Veterinária Brasileira 31(1):23-30. Departamento de Medicina Veterinária Preventiva, Universidade Federal de Santa Maria, Camobi, Santa Maria, RS 97105-900, Brazil. E-mail: eduardofurtadoflores@gmail.com O herpesvírus bovino tipo 5 (BoHV-5) é um importante patógeno de bovinos na América do Sul e tem suscitado esforços para o desenvolvimento de vacinas mais seguras e eficazes. Além de conferirem proteção, vacinas contra os herpesvírus animais devem permitir a diferenciação sorológica entre animais vacinados e infectados naturalmente. Foi recentemente relatada a construção e caracterização in vitro de um recombinante do BoHV-5 defectivo na enzima timidina quinase (tk) para atenuação e, na glicoproteína E (gE) como marcador antigênico, como potencial cepa vacinal (Brum et al. 2010a). O presente artigo relata uma investigação sobre da atenuação e imunogenicidade do recombinante BoHV-5gE/TKD em bezerros. Em um primeiro experimento, bezerros soronegativos, com 80 a 90 dias de idade (n=6), inoculados pela via intranasal (IN) com o vírus recombinante (título de 107,5TCID50) excretaram baixos títulos de vírus nas secreções nasais por até seis dias, mas não desenvolveram sinais sistêmicos, respiratórios ou neurológicos. No dia 30 pós-infecção (pi), todos os animais possuíam anticorpos neutralizantes contra o BoHV-5, em títulos entre 4 e 8, mas permaneceram negativos para anticorpos contra a gE. Administração de dexametasona (Dx) a quatro desses bezerros no dia 42 pi (0.1mg/kg/dia durante 5 dias) não resultou em excreção viral ou em aumento dos títulos de anticorpos, indicando ausência de reativação viral. Em um segundo experimento, vacinação intramuscular (IM) de bezerros com 8 meses de idade (n=9) com o recombinante (107,5TCID50/animal) não resultou em excreção viral ou em manifestações clínicas. Os animais vacinados desenvolveram anticorpos neutralizantes em títulos de 2 a 8 no dia 42 pós-vacinação (PV) e permaneceram negativos para anticorpos anti-gE. Finalmente, 21 bezerros (aproximadamente 10 meses de idade) mantidos a campo foram vacinados com o recombinante (107,3TCID50) pela via IM. Todos os animais vacinados desenvolveram anticorpos neutralizantes em títulos de 2 a 16 no dia 30pv. Revacinação desses animais no dia 240 pv provocou uma resposta anamnéstica rápida e intensa, resultando em títulos neutralizantes entre 16 e 256 no dia 14 pós-revacinação. O soro de todos os animais permaneceu negativos para anticorpos contra a gE. Amostras de soro dos animais vacinados apresentaram atividade neutralizante cruzada frente a nove isolados de BoHV-5 e oito de BoHV-1. Esses resultados demonstram que o recombinante é atenuado e imunogênico para bezerros e induz uma resposta sorológica diferenciável da resposta à infecção natural. Portanto, o recombinante se constitui em um potencial candidato a cepa vacinal.