PESQUISA VETERINÁRIA BRASILEIRA

Abstract in English:

Production biotechnologies, particularly embryo transfer (ET) has constantly been contributed to reproduce horses and other species. The mules market has shown continuous growth, however, the biotechnology for mule assisted reproduction is still scarce. The aim of this study was to evaluate the embryo recovery rate and the features of the embryos from mares bred with donkeys. The embryos recovery attempts were performed on days 6 to 9 after ovulation, in order to evaluate the embryo recovery rate and the features related to age, morphology and embryonic diameter in each day. The overall embryo recovery rate was 55,9% (71/127), and there was no significant difference (p>0,05) on different days (D6‑D9). Embryos were recovered in stages of mórula, early blastocyst, blastocyst and expanded blastocyst. The diameter of the embryos ranged from 147-1688µm and the mean diameter of all the embryos collected was 438,04µm. The collection of hybrid embryos might be performed between days 6 and 9 after ovulation, and provides recovery of embryos in the early stages of development.

• Recovery rate morphology cross bred embryos Equus caballus Equus asinus embryo transfer hybrid mare

Abstract in Portuguese:

A Transferência de Embrião (TE) contribuiu efetivamente para a produção de equinos e outras espécies. O mercado de muares tem apresentado um contínuo crescimento, entretanto, a aplicação das biotecnologias para a produção desses animais ainda é escassa. O presente estudo avaliou a taxa de recuperação embrionária e as características dos embriões provenientes do cruzamento de éguas com jumentos. Os embriões foram recuperados entre os dias 6 e 9 após a ovulação, dessa forma foi realizada a avaliação da taxa de recuperação embrionária e avaliação das características relacionadas com a idade, morfologia e diâmetro embrionário. A taxa de recuperação embrionária total foi de 55,9% (71/127), e não apresentou diferença para as colheitas realizadas em diferentes dias (D6-D9). Foram recuperados embriões nos estágios de mórula, blastocisto inicial, blastocisto e blastocisto expandido. O tamanho dos embriões variou entre 147-1688µm e a média do diâmetro de todos os embriões recuperados foi de 438,04µm. A recuperação de embriões muares pode ser realizada entre os dias 6 e 9 após a ovulação, e propicia a recuperação de embriões nos primeiros estágios de desenvolvimento.

• Recuperação embrião Equus caballus Equus asinus transferência de embrião híbrido égua mula

Abstract in English:

ABSTRACT.- Meneghel M., Dall’Acqua P.C., Ambrogi M., Leão B.C.S., Rocha-Frigoni N.A.S. & Mingoti G.Z. 2017. Lipid content and cryotolerance of in vitro-produced bovine embryos treated with forskolin before vitrification. Pesquisa Veterinária Brasileira 37(4):395-400. Departamento de Apoio, Produção e Saúde Animal, Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Estadual Paulista, Rua Clóvis Pestana 793, Dona Amélia, Araçatuba, SP 16050-680, Brazil. E-mail: gmingoti@fmva.unesp.br The aim of the present study was to evaluate the intracytoplasmic lipid content, development and cryotolerance of in vitro-produced bovine embryos treated with different concentrations of forskolin before vitrification. Embryos were produced from abattoir-derived ovaries and allocated into four groups. In the treatment groups, forskolin was added to the in vitro culture medium on Day 6 and incubated for 24 hours in one of the following concentrations: 2.5&#956;M (Forsk 2.5 group), 5.0&#956;M (Forsk 5.0 group) or 10.0&#956;M (Forsk 10.0 group). Embryos from the control group were cultured without forskolin. On Day 7 of culture, the expanded blastocysts were stained with the lipophilic dye Sudan Black B for determination of the intracytoplasmic lipid content or were cryopreserved via the Vitri-Ingá® procedure. Although there were no significant differences (P>0.05) in the blastocyst rates between the Control group (44.9%) and the other treatments, the embryo production was lower (P<0.05) in Forsk 10.0 group (38.8%) compared to Forsk 2.5 (50.5%) and Forsk 5.0 (54.7%) groups. The intracytoplasmic lipid content (expressed in arbitrary units of pixels) in blastocysts from the Control group (1.00±0.03) was similar (P>0.05) to that found in Forsk 2.5 (0.92±0.03) and Forsk 10.0 groups (1.06±0.03) groups; however the lipid accumulation in blastocysts from Forsk 5.0 group (0.82±0.04) was lower than in the Control group (P<0.05). Based on these results, Forsk 5.0 treatment was tested for cryotolerance and it was observed that the blastocoel re-expansion rate evaluated 24 hours after warming was greater (P<0.05) in Forsk 5.0 group (72.2%) compared to the Control group (46.2%). In conclusion, pre-treatment with forskolin at a concentration of 5.0 &#956;M for 24 hours before vitrification is effective in reducing the intracytoplasmic lipid content and, consequently, improves cryotolerance of IVP bovine embryos.

• Lipid content cryotolerance forskolin vitrification embryo cryotolerance lipídios intracitoplasmáticos criotolerância forskolin vitrificação embrião

Abstract in Portuguese:

RESUMO.- Meneghel M., Dall’Acqua P.C., Ambrogi M., Leão B.C.S., Rocha-Frigoni N.A.S. & Mingoti G.Z. 2017. Lipid content and cryotolerance of in vitro-produced bovine embryos treated with forskolin before vitrification. [Acúmulo de lipídios intracitoplasmáticos, desenvolvimento e criotolerância de embriões bovinos produzidos in vitro e tratados com diferentes concentrações de forskolin antes da vitrificação.] Pesquisa Veterinária Brasileira 37(4):395-400. Departamento de Apoio, Produção e Saúde Animal, Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Estadual Paulista, Rua Clóvis Pestana 793, Dona Amélia, Araçatuba, SP 16050-680, Brazil. E-mail: gmingoti@fmva.unesp.br Os embriões foram produzidos a part ir de ovários obtidos em abatedouro e foram alocados em quatro grupos experimentais. Nos grupos tratados, o forskolin foi adicionado ao meio de cultivo in vitro no dia 6 do cultivo e os embriões foram incubados durante 24 horas com uma das seguintes concentrações: 2,5&#956;M (grupo Forsk 2,5), 5,0&#956;M (grupo Forsk 5,0) ou 10,0&#956;M (grupo Forsk 10,0). Os embriões do grupo controle foram cultivados na ausência de forskolin. No dia 7 do cultivo, os blastocistos expandidos foram corados com o corante lipofílico Sudan Black B para a determinação do teor de lípidos intracitoplasmáticos ou foram criopreservados através do protocolo Vitri-Ingá®. Não foi observada diferença significativa (P>0,05) na taxa de produção de blastocistos entre o grupo Controle (44,9%) e os demais tratamentos, todavia observou-se menor produção de embriões (P<0,05) no grupo Forsk 10,0 (38,8%) em comparação com os grupos Forsk 2,5 (50,5%) e Forsk 5,0 (54,7%). A quantidade de lipídeos intracitoplasmáticos do grupo Controle (1,00±0,03) foi semelhante (P>0,05) a dos grupos Forsk 2,5 (0,92±0,03) e Forsk 10,0 (1,06±0,03); no entanto, o acúmulo de lípidos nos blastocistos do grupo Forsk 5.0 (0,82 ± 0,04) foi menor do que no grupo controle (P<0,05). A partir destes resultados, o grupo Forsk 5,0 foi testado quanto à criotolerância e foi observado que a taxa de re-expansão da blastocele 24 horas após o aquecimento foi maior (P<0,05) no grupo Forsk 5,0 (72,2%) quando comparado ao grupo Controle (46,2%). Em conclusão, o pré-tratamento com forskolin na concentração de 5,0 &#956;M durante 24 horas antes da vitrificação foi eficiente para promover a redução da quantidade de lipídeos intracitoplasmáticos e, consequentemente, melhorou a criotolerância de embriões bovinos produzidos in vitro.

Abstract in English:

ABSTRACT.- Arnold D.R., Corrêa C.A.P., Lorena L.L.G., Gaspar R.C., Rossi G.F., Ifran A.M., Penteado J.C.T., Mingoti G. & Lopes F.L. 2015. Supplementation of fetal bovine serum alters histone modification H3R26me2 during preimplantation development of in vitro produced bovine embryos. Pesquisa Veterinária Brasileira 35(7):605-612. Departamento de Apoio, Produção e Saúde Animal, Faculdade de Medicina Veterinária de Araçatuba, Universidade Estadual Paulista, Rua Clovis Pestana 793, Araçatuba, SP 16050-680, Brazil. E-mail: flavialopes@fmva.unesp.br In vitro production (IVP) of bovine embryos is not only of great economic importance to the cattle industry, but is also an important model for studying embryo development. The aim of this study was to evaluate the histone modification, H3R26me2 during pre-implantation development of IVP bovine embryos cultured with or without serum supplementation and how these in vitro treatments compared to in vivo embryos at the morula stage. After in vitro maturation and fertilization, bovine embryos were cultured with either 0 or 2.5% fetal bovine serum (FBS). Development was evaluated and embryos were collected and fixed at different stages during development (2-, 4-, 8-, 16-cell, morula and blastocyst). Fixed embryos were then used for immunofluorescence utilizing an antibody for H3R26me2. Images of stained embryos were analyzed as a percentage of total DNA. Embryos cultured with 2.5% FBS developed to blastocysts at a greater rate than 0%FBS groups (34.85+5.43% vs. 23.38+2.93%; P<0.05). Levels of H3R26me2 changed for both groups over development. In the 0%FBS group, the greatest amount of H3R26me2 staining was at the 4-cell (P<0.05), 16-cell (P<0.05) and morula (P<0.05) stages. In the 2.5%FBS group, only 4-cell stage embryos were significantly higher than all other stages (P<0.01). Morula stage in vivo embryos had similar levels as the 0%FBS group, and both were significantly higher than the 2.5%FBS group. These results suggest that the histone modification H3R26me2 is regulated during development of pre-implantation bovine embryos, and that culture conditions greatly alter this regulation.

• Embryo development H3R26me2 desenvolvimento embrionário

Abstract in Portuguese:

RESUMO.- Arnold D.R., Corrêa C.A.P., Lorena L.L.G., Gaspar R.C., Rossi G.F., Ifran A.M., Penteado J.C.T., Mingoti G. & Lopes F.L. 2015. Supplementation of fetal bovine serum alters histone modification H3R26me2 during preimplantation development of in vitro produced bovine embryos. [Suplementação com soro fetal bovino altera a modificação de histona H3R26me2 durante o período pré-implantacional em embriões bovinos produzidos in vitro.] Pesquisa Veterinária Brasileira 35(7):605-612. Departamento de Apoio, Produção e Saúde Animal, Faculdade de Medicina Veterinária de Araçatuba, Universidade Estadual Paulista, Rua Clovis Pestana 793, Araçatuba, SP 16050-680, Brazil. E-mail: flavialopes@fmva.unesp.br A produção in vitro (PIV) de embriões de bovinos não é apenas de grande importância econômica para a pecuária, mas é também um importante modelo para estudar o desenvolvimento embrionário. O objetivo deste estudo foi avaliar a modificação de histona, H3R26me2 durante o desenvolvimento pré-implantacional em embriões bovinos produzidos in vitro, cultivados com ou sem suplementação de soro fetal bovino (SFB), bem como comparar essa modificação específica entre mórulas produzidas in vitro e in vivo. Após a maturação in vitro e fertilização, embriões foram cultivados com suplementação de 0 ou 2,5% SFB. O desenvolvimento embrionário foi avaliado e embriões foram coletados e fixados em diferentes fases durante o desenvolvimento (2, 4, 8 e 16 células, mórula e blastocisto). Os embriões fixados foram avaliados por imunofluorescência utilizando um anticorpo para H3R26me2. Imagens de embriões corados foram analisadas baseadas na porcentagem do DNA total. Embriões cultivados com 2,5% SFB tiveram uma taxa de desenvolvimento ao estágio de blastocisto maior que o grupo que não recebeu suplementação com SFB (34.85±5,43% vs 23.38±,93%; P<0,05). Níveis de H3R26me2 variaram para ambos os grupos ao longo do desenvolvimento. No grupo 0% SFB, a marcação para H3R26me2 foi mais intensa nos estágios de 4 células (P<0,05), 16 células (P<0,05) e mórula (P<0.05). No grupo 2.5% SFB, apenas os embriões de 4 células tiveram marcação significativamente maior que todas as outras fases (P<0,01). Mórulas produzidas in vivo apresentaram níveis de H3R26me2 semelhantes ao grupo 0% SFB, e ambos foram significativamente maiores que o grupo 2.5% SFB. Estes resultados sugerem que a modificação de histona H3R26me2 é regulada durante o desenvolvimento pré-implantacional de embriões bovinos, e que as condições de cultura alteram de maneira importante esta regulação.

Abstract in English:

ABSTRACT.- Martins L.R., Fernandes, C.B., Villaverde A.I.S.B., Landim-Alvarenga F.C. & Lopes M.D. 2014. The seasonal and ovarian status effects on in vitro production of domestic cat embryos in a region between Equator and Tropic of Capricorn. Pesquisa Veterinária Brasileira 34(3):277-280. Laboratório de Reprodução Animal, Curso de Medicina Veterinária, Universidade Federal de Mato Grosso, Av. Alexandre Ferronato 1200, Sinop, MT 78557-267, Brazil. E-mail: lirigatto@yahoo.com.br From the Tropic of Capricorn to Equator, the seasonality of domestic cat is known to be absent, i.e., these animals are considered non-seasonal breeders at these regions. We hypothesized that this particularity might have some influence on in vitro embryo production. The aim of this experiment was to determine the percentage of cleavage and morulae and blastocyst formation produced from oocytes recovered from queen ovaries of three distinct status - follicular, luteal or inactive - during two different reproductive seasons experienced by cats in southeast of Brazil (22°53’09” S and 48°26’42” W) – non breeding season (NBS), comprehending January to March; and breeding season (BS), August to October. Thirty queens were neutered. Ovaries were classified according to their status and were sliced in PBS for cumulus oocyte complex (COC) releasing. Grade I COC were washed three times in H-MEM supplemented with BSA, glutamine, sodium pyruvate, cysteine, streptomycin and penicillin. Oocytes were incubated in groups of 20-30 in 400µL of DMEM supplemented with FSH, LH, estradiol, IGF-I and basic fibroblast growth factor under mineral oil for 30 or 36 hours at 38°C in humidified environment of 5% de O2, 5% CO2 and 90% N2. COC were fertilized in Ham’s F-10 medium supplemented with BSA, cysteine, pyruvate and streptomycin/penicillin (culture medium) with fresh semen selected through swim up technique. Eighteen hours later, the presumptive zygotes were denuded, the percentage of cleavage was determined and every 10 zygotes were transferred to 100mL drops of culture medium for culture during three days. After 72 hours of culture the percentage of morulae formation was evaluated and these structures were transferred to drops of the same culture medium. At the eighth day of culture blastocyst formation was analyzed. During NBS, from a total of 272 (inactive), 162 (luteal) and 134 (follicular) fertilized oocytes, the percentage of cleaved zygotes, morulae and blastocysts derived from inactive ovaries were 24.63, 16.54 and 8.09 respectively; for those derived from luteal ovaries, the percentage was 21.6, 12.96 and 8.64, and for those from follicular ovaries, they were 24.62, 16.41 and 8.21. Considering BS, from a total of 102 (inactive), 198 (luteal) and 86 (follicular) fertilized oocytes, the relative frequency (%) of cleaved zygotes, morulae and blastocysts derived from inactive ovaries were 64.7, 41.17 and 23.53 respectively; for those derived from luteal ovaries, the percentage was 64.14, 40.41 and 23.73, and for those from follicular ovaries, they were 63.95, 39.54 and 24.41. The results of this experiment demonstrate that no statistically significant difference (P<0.05) was verified in the frequency of cleaved embryos and morulae and blastocyst formation when comparing the three ovarian conditions in the same season. However the breeding season presented better results considering cleavage and morulae and blastocyst formation.

• Seasonality oocyte sazonalidade oócito

Abstract in Portuguese:

RESUMO.- Martins L.R., Fernandes, C.B., Villaverde A.I.S.B., Landim-Alvarenga F.C. & Lopes M.D. 2014. The seasonal and ovarian status effects on in vitro production of domestic cat embryos in a region between Equator and Tropic of Capricorn. [Efeitos da sazonalidade e da condição ovariana sobre a produção in vitro de embriões de gatos domésticos em uma região entre o Equador e o Trópico de Capricórnio.] Pesquisa Veterinária Brasileira 34(3):277-280. Laboratório de Reprodução Animal, Curso de Medicina Veterinária, Universidade Federal de Mato Grosso, Av. Alexandre Ferronato 1200, Sinop, MT 78557-267, Brazil. E-mail: lirigatto@yahoo.com.br Do Trópico de Capricórnio ao Equador, sabe-se que a sazonalidade no gato domestico é ausente, i.e., estes animais são considerados reprodutores não sazonais nestas regiões. Nós hipotetizamos que esta particularidade possa ter alguma influência sobre a produção embrionária in vitro. O objetivo deste experimento foi determinar a porcentagem de clivagem e formação de mórulas e blastocistos produzidos a partir de oócitos recuperados de ovários de gatas em três condições - folicular, lútea ou inativa – durante duas estações reprodutivas pelas quais gatas passam na região sudeste do Brasil (22°53’09” S e 48°26’42” O) - estação não reprodutiva (ENR), que compreende os meses de janeiro a março; e estação reprodutiva (ER), agosto à outubro. Trinta gatas foram castradas. Os ovários foram classificados de acordo com sua condição e foram fatiados em PBS para liberação dos complexos cumulus oophorus (COC). COC grau I foram lavados três vezes em H-MEM suplementado com BSA, glutamina, piruvato sódico, cisteína, estreptomicina e penicilina. Os oócitos foram incubados em grupos de 20-30 em 400 µL de DMEM suplementado com FSH, LH, estradiol, IGF-I e fator de crescimento fibroblástico básico sob óleo mineral por 30 ou 36 horas em atmosfera úmida de 5% de O2, 5% CO2 e 90% N2 a 38°C. Os COC foram fertilizados em meio Ham’s F-10 suplementado com BSA, cisteína, piruvato e estreptomicina/penicilina (meio de cultura) com sêmen fresco selecionado através da técnica de swim up. Dezoito horas depois, os presumíveis zigotos foram denudados, a porcentagem de clivagem foi determinada e cada 10 zigotos foram transferidos para gotas de 100 mL de meio de cultura para cultivo durante 3 dias. Após 72 horas de cultivo, a porcentagem de formação de mórulas foi avaliada e estas estruturas foram transferidas para gotas do mesmo meio de cultivo. No oitavo dia de cultivo a formação de blastocisto foi avaliada. Durante a ENR, de um total de 272 (inativo), 162 (lútea) e 134 (folicular) oócitos fertilizados, a porcentagem de clivagem de zigotos, formação de mórulas e de blastocistos derivados de ovários inativos foi 24,63, 16,54 e 8,09 respectivamente; para aqueles oriundos de ovários na condição lútea, a porcentagem foi de 21,6, 12,96 e 8,64, e para aqueles provenientes de ovários na fase folicular, foi de 24,62, 16,41 e 8,21. Considerando a ER, de um total de 102 (inativo), 198 (lútea) e 86 (folicular) oócitos fertilizados, a frequência relativa (%) de zigotos clivados, mórulas e blastocistos derivados de ovários na condição inativa foi de 64,7, 41,17 e 23,53 respectivamente; para aqueles oriundos de ovários na condição lútea, a porcentagem foi de 64,14, 40,41 e 23,73, e para aqueles provenientes de ovários na fase folicular, foi de 63,95, 39,54 e 24,41. Os resultados deste experimento demonstraram que não houve diferença estatística significante (P < 0.05) na frequência de embriões clivados e na formação de mórulas e blastocistos quando comparadas as três condições ovarianas dentro da mesma estação. Entretanto, a ER apresentou resultados melhores considerando as taxas de clivagem e formação de mórula e de blastocisto se comparada à ENR.